抗菌肽是宿主防御系统产生的一类抵抗外界病原体感染的肽类物质,也是宿主免疫防御系统的重要组成部分。抗菌肽不仅具有广泛的抗菌谱,而且有抑制癌细胞生长的作用及不易产生耐药性的特点,这使得抗菌肽开发利用成为近来的研究热点。但是抗菌肽的研究和利用并非易事,首先,抗菌肽天然资源有限,提取非常复杂；其次,化学合成,不但成本很高,还对环境造成严重污染,因此迫切需要一种高效表达抗菌肽的工程菌。在构建抗菌肽工程菌的过程中,最需要解决的关键技术问题是如何快速高效克隆,和如何准确表达抗菌肽。 高效克隆是现在研究抗菌肽的第一个瓶颈,由于抗菌肽的分子量比较小,抗菌肽编码基因的cDNA片段较小,通常仅有几百bp以下,有的甚至只有几十bp,给抗菌肽基因工程操作带来极大困难。常规的酶切酶连方法构建表达载体不仅费时而且不经济,另外,抗菌肽基因非常小,实验室一般的质粒检测和PCR检测的方法对于验证表达载体很困难。所以如何高效克隆抗菌肽成为了制约抗菌肽发展应用的又一个障碍。 本研究利用绿色荧光蛋白（GFP）具有独特的发光性质,并采用猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）定点突变外壳蛋白（EDDIE）为融合蛋白,构建了一种能高效准确表达抗菌肽的载体pET30a-EDDIE-GFP。首先PCR扩增GFP基因,同时以pET30a-EDDIE-CAD为模板反扩,反扩产物不含有CAD基因,并且两端含有GFP基因两端的同源序列,接着将GFP基因扩增产物与反扩产物同时转入XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,构建成pET30a-EDDIE-GFP克隆载体。选择六种不同分子大小的抗菌肽为例,六种抗菌肽分别编号为027、054、099、801、803和726,以pET30a-EDDIE-GFP克隆载体为模板进行重叠反扩,将反扩产物直接转化XL-GOLD感受态细胞中进行同源重组,获得抗菌肽标的载体。然后转化大肠杆菌BL21（DE3）表达,通过抗菌肽抑菌活性的检测,结果发现利用该方法六种小肽能准确表达抗菌肽。