研究背景:近十年来,以伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)的广泛应用,彻底改变了慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的治疗过程和理念,从延长生存到走向长期生存并改善生活质量,TKIs极大地改变了 CML的预后,并带动了肿瘤分子靶向药物的井喷式研发。但仍有部分患者出现对IM治疗反应不佳、耐药等进而出现治疗失败的情况依旧是目前困扰临床和基础研究的难题,不断激励着人们去探索。既往TKI耐药研究关注的重点是细胞内源性因素,主要集中于BCR-ABL依赖的或非BCR-ABL依赖途径等的研究。随着研究的深入,外在性因素即肿瘤微环境介导的耐药愈发受到重视。在血液恶性肿瘤中,骨髓微环境不仅可以支持正常造血细胞的生长、增殖,在长期与白血病细胞共生的条件下,骨髓基质细胞发生了利于肿瘤细胞生长的改变,支持肿瘤细胞的生长、增殖甚至保护其逃避化疗药物引起的凋亡。目前研究表明,骨髓微环境导致的白血病耐药可能有以下几个方面:基质细胞产生可溶性因子介导的耐药;基质细胞与肿瘤细胞黏附性增加介导的耐药;微环境上调肿瘤细胞耐药基因表达介导的耐药;基质细胞对白血病细胞代谢的调节及基质细胞改变肿瘤细胞周期介导的耐药等。促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin producing human hepatocellular receptor,Eph)是最大的酪氨酸激酶受体蛋白家族,其配体称之为Ephrin,Eph/Ephrin介导的双向信号通路在体内多个系统以及实体瘤、血液肿瘤的进展和转移中发挥重要作用。EphB4及其配体EphrinB2构成的信号通路是目前Eph家族中研究的热点之一。EphB4与其配体EphrinB2特异性结合后通过发生磷酸化激活下游多个蛋白,从而参与血管生成、细胞迁移、骨稳态及造血生成等。同时,多项研究表明EphB4与实体瘤的发生及耐药相关,但其在血液肿瘤的研究中相对较少。我们组在前期工作中发现,K562-R细胞株高表达EphB4,在细胞水平发现EphB4参与了 CML肿瘤细胞的迁移、侵袭以及耐药过程。目前已明确Eph/Ephrin与细胞的运动和黏附有关,并且EphB4可以调节的相互作用,参与了细胞黏附介导的耐药过程,但其作用机制仍未明确。Ombretta等研究发现,EphB4在体外实验中可以刺激人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)上SDF1的分泌,并协同促进了 SDF-1/CXCR4轴介导的细胞迁移及血管生成作用。Thao M.等进行的动物实验发现EphB4参与调控造血生成且促进基质细胞上SDF-1分泌增加。基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor,SDF-1)是生物体内一种关键的细胞趋化因子,与其受体CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)构成重要的信号轴,参与介导炎症反应、造血干细胞迁移以及归巢、恶性肿瘤尤其是白血病的细胞增殖、耐药、浸润及转移等。基质细胞分泌的SDF-1可通过与白血病细胞上的CXCR4结合,活化下游信号通路从而诱导白血病细胞归巢并通过黏附作用增加CML细胞对骨髓腔的黏附,避免TKI的杀伤作用而导致耐药。目前科研人员已研发多种CXCR4抑制剂,其中,CXCR4特异性拮抗剂Plerixafor(AMD3100)已面市并通过与粒细胞集落刺激因子(G-CSF)联合用药应用于自体造血干细胞移植。我们希望通过本实验了解骨髓微环境下EphB4参与的细胞黏附介导的耐药过程是否与SDF-1/CXCR4轴相关,是否可通过联合伊马替尼及AMD3100的治疗来提高CML伊马替尼耐药病人的治疗效果?研究目的:本课题研究目标为探索模拟骨髓微环境下,EphB4是否协同SDF1/CXCR4轴参与介导微环境耐药及联合用药是否可提高伊马替尼对肿瘤细胞的杀伤作用。研究方法:1.收集CML初发、慢性期(CP)、急变期(BC)(非BCR/ABL点突变)及正常人(HC)骨髓标本;分离骨髓单个核细胞及骨髓间充质干细胞(MSCs)2.细胞培养:经知情同意,收集正常供者骨髓标本,全骨髓法分离MSC,10%胎牛血清成人骨髓间充质干细胞完全培养基培养。10%胎牛血清RPMI-1640培养基培养K562、K562-R、K562-R-EphB4-sh细胞。所有细胞株均在南方医院血液科实验室培养,选取对数生长期细胞进行实验。3.提取RNA,检测RNA浓度并利用QT-PCR方法对实验的目的蛋白进行mRNA水平检测。4.利用RIPA裂解液裂解细胞,并用BCA法检测蛋白浓度,利用westernblot方法检测处理后基质细胞及肿瘤细胞的目的蛋白表达水平。5.CCK8 测定:分别取 K562、K562-R、K562-R-EphB4-Sh 细胞,按 1×104/孔浓度加于96孔板,每孔加入90ul培养基,分别加入浓度0-64mmol/L的IM10ul孵育72h,设定终浓度为0-6.4mmol/L。孵育完成后每孔加入10ulCCK-8,培养箱避光孵育4h,酶标仪450nm处曝光测定细胞抑制率。细胞增殖抑制率(%)=[(对照孔-实验孔)/(对照孔-空白孔)]×100%。不同细胞株之间的IC50比值即为下阶段细胞的处理药物浓度。6.利用transwell小室进行迁移实验,比较处理前后细胞迁移能力的变化。7.使用Calckin-AM对肿瘤细胞进行染色,加入接种MSC细胞的96孔板中,比较EphB4处理前后共培养体系黏附作用的变化。8.共培养体系:取活性较好的第2～5代处于对数生长期的MSC细胞接种于培养皿或孔板,培育24小时,观察基质细胞贴壁形成基质细胞层后,以1:5的比例加入悬浮细胞,并用成人间充质干细胞完全培养基继续培养。9.Annexin V凋亡检测:用Annexin V apc/7aad双染凋亡试剂盒检测不同细胞株在不同处理条件下的凋亡率,流式细胞仪分析检测结果。10.动物实验:本实验使用4～5周龄NOG裸鼠,皮下注射或骨髓腔注射K562-R细胞及 K562-R+MSC 细胞或 K562-R-EphB4-Sh 及 K562-R-EphB4-Sh+MSC细胞,微米卡尺测量皮下肿块长短径,电子天平测量小鼠重量,并记录成瘤时间及死亡时间。11.统计方法:采用SPSS13.0软件处理数据,所有实验重复3次。计量资料采用均数±标准差表示。多组间均数比较,方差齐时使用单因素方差分析进行比较,方差不齐时使用近似Welch法比较。组内多重比较时,方差齐则采用LSD法,方差不齐采用Dunnett’sT3方法。两组间均数比较则采用两独立样本t检验。当P<0.05时,差异具有统计学意义。研究结果:1.1.EphB4及CXCR4在慢性髓性白血病进展期患者中表达明显升高采用实时荧光定量PCR对初发、慢性期及耐伊马替尼的慢性髓性白血病患者及正常人骨髓EphB4、CXCR4进行mRNA水平筛查(2-△Ct值),实验发现EphB4及CXCR4的表达在此四个组间有明显差异(F=23.294,p<0.001;F=11.110,p<0.001),其中,EphB4及CXCR4在耐药组中较初发组、慢性期组及正常对照组表达增加(EphB4:p<0.001,p<0.001,p<0.001;CXCR4:p<0.001,p<0.001,p<0.001)。2.K562、K562-R、K562-R-EphB4-sh 细胞株 EphB4 表达水平的差异采用实时荧光定量 PCR 及 Westerblot 对 K562、K562-R、K562-R-EphB4-sh三个细胞株的EphB4表达水平进行检测,mRNA水平上,三者表达具有明显差异(F=361.131,p<0.001),其中K562-R的EphB4表达水平高于另外两组(p<0.001,p<0.001),K562-R-EphB4-sh 表达明显低于 K562 细胞株及 K562-R细胞株(P<0.001,p<0.001)。蛋白水平的表达结果相似。3.K562、K562-R、K562-R-EphB4-sh细胞株直接耐药倍数存在差异采用cck8法检测3个细胞株对伊马替尼的药物敏感性,三组有明显统计学差异(F=287.875,p<0.001)。其中,K562-R 耐药性最强(p<0.001,p<0.001),K562对伊马替尼敏感性最强(p<0.001,p<0.001)。4.MSC 上表达 EphrinB2 和 SDF-1用westernblot方法检测目的蛋白表达水平,发现MSC细胞上表达Ephrinb2蛋白,且同时表达SDF1蛋白。采用实时荧光定量PCR进行检测,发现CML不同时期及正常人MSC细胞上EphrinB2和SDF-1表达水平存在差异(F=126.733,p<0.001;F=34.136,p=0.001)。其中,EphrinB2在慢性期表达高于正常供者及急变期患者(p=0.001,p<0.001),而SDF-1在急变期患者骨髓MSC上表达较正常供者及慢性期患者明显升高(p=0.001,p<0.001)。5.通过EphB4-Fc直接刺激骨髓MSC,利用westernblot及RT-PCR方法均可检测到与Leptin-Fc对照组相比,刺激后MSC上SDF-1表达增加(t=-5.284,p=0.011)6.利用transwell小室,在模拟骨髓微环境中,EphB4-Fc刺激MSC后K562细胞迁移能力明显增强(t=10.253,p=0.001),同时,黏附能力也明显提高(t=7.797,p=0.001)。在CXCR4特异性拮抗剂AMD3100作用下,EphB4对K562细胞的迁移、黏附能力的作用可一定程度被逆转(F=62.09,p<0.001;F=40.533,p<0.001)。7.在肿瘤细胞与MSC细胞共培养体系中,通过westernblot及实时荧光定量PCR检测,各组肿瘤细胞表达CXCR4均有差异(F=966,p<0.001),其中,通过与MSC共培养,K562-R细胞上CXCR4蛋白表达增加(p<0.001)。8.共培养体系提高细胞株对伊马替尼的耐药作用通过肿瘤细胞与MSC细胞共培养,模拟骨髓微环境,利用Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡试剂盒检测伊马替尼对肿瘤细胞的杀伤作用,差异有统计学意义(F=102.331,p<0.001)。在每个细胞株单独培养对应的IC50值的药物作用下,共培养组明显细胞凋亡率减少(p=0.031,p<0.001,p<0.001),K562-R共培养组凋亡率减少较另外两组明显(p<0.001,p<0.001),K562-R-EphB4-sh共培养组凋亡率减少高于K562共培养组(p<0.001)。使用伊马替尼联合AMD3100重复上诉实验可发现AMD3100可一定程度增加肿瘤细胞的凋亡(F=81.889,p<0.001),且在共培养组中较单独培养组明显(p<0.001,p<0.001,p<0.001),并且对K562-R共培养组作用最强(p<0.001,p<0.001)9.在皮下成瘤组中,不同处理组之间成瘤时间及实验终点瘤体体积均有明显差异(F=8.767,p=0.007;F=368.01,p<0.001)。其中,共培养组较单独培养组成瘤时间短(p=0.012,p=0.009),瘤体体积大(p<0.001,p=0,001)。通过组化可检测到K562-R与MSC共培养组CXCR4表达水平最高(p<0.05)。治疗上,伊马替尼治疗后各组小鼠瘤体体积均有增大,伊马替尼对共培养组治疗效果差于单独培养组(p<0.001,p<0.001),同时K562-R单独培养组或共培养组瘤体体积较K562-EphB4-sh单独培养组或共培养组增大明显(p=0.031,p<0.001),伊马替尼联合AMD3100对K562-R共培养组有明显治疗作用。10.在骨髓腔成瘤组中,不同处理组之间成瘤时间及小鼠存活时间均有明显差异(F=81.698,p<0.001;F=20.286,p<0.001),且 K562-R 与 MSC 共培养组成瘤时间最短(p<0.05),存活时间上共培养组较单独培养组存活时间短(p<0.001,p<0.001),而组内无明显差异(p=0.316,p=0.147)。免疫组化可检测到K562-R与MSC共培养组CXCR4表达水平最高(p<0.05)。治疗上,伊马替尼对共培养组治疗效果差于单独培养组(p<0.001,p<0.001),同时K562-R单独培养组或共培养组生存时间较K562-EphB4-sh单独培养组或共培养组缩短(p=0.009,p=0.013),且伊马替尼联合AMD3100对两个共培养组有明显治疗作用。研究结论:1.慢性髓性白血病急变期患者EphB4、CXCR4表达明显升高;2.K562、K562-R、K562-R-EphB4-sh细胞株EphB4表达水平不同,耐药性也不尽相同;3.EphB4在骨髓微环境下可能通过上调MSC细胞中SDF1的表达,进而增加肿瘤细胞上CXCR4的表达,从而通过协同SDF1/CXCR4轴的作用来介导肿瘤的耐药作用;4.AMD3100与伊马替尼联合可以一定程度逆转骨髓微环境下肿瘤细胞对伊马替尼的耐药作用。