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目的:胰腺癌是一种临床表现隐匿、早期诊断困难、发展迅速,而且预后极差的消化系统恶性肿瘤,胰腺癌诊治的关键,是需要早期发现和诊断胰腺癌,针对胰腺癌/疑似胰腺癌病人进行相关分子标志物的风险评估,并给予早期、及时地干预以预防恶化,这无疑将对胰腺癌诊治产生积极作用。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种拥有独特环状结构的非编码RNA,其具有物种保守性及组织特异性,circRNA极其稳定,共价键结合使其形成了独特并稳定的闭环结构,这种结构使其不存在3’端和5’端,因此在细胞,组织甚至体液中,其能够逃避核酸酶的酶切作用从而稳定存在,上述特性使得circ RNA成为较理想的疾病诊断的生物标志物。既往关于胰腺癌的研究大部分局限于DNA水平及基因突变检测其遗传学改变,缺乏对胰腺癌全面系统的认识。癌症相关转录组的研究目前广受关注,其核心为研究蛋白编码的信使RNA以及非编码转录产物,如微小RNA(microRNA,mi RNA)、假基因,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)、circRNA等的异常表达。miRNA是一类长度约为19nt-25nt的由内源性基因编码产生的非编码单链RNA,在胚胎发育、细胞分化以及器官发生等生物发展进程中承担着关键性的调控作用,研究miRNA调控网络以及RNA调控网络对深入理解疾病的发生发展、探讨潜在药物作用靶点等意义重大。利用高通量测序技术灵敏度高,测序通量大,数据深度与覆盖率大等特点,对胰腺癌进行miRNA表达水平的分析,有利于发现新的种类并检测到丰度较低的转录本,极大地扩充了对疾病差异分子表达谱的理解与认知。假基因,LncRNA及circ RNA可以通过竞争性结合miRNA起到调控作用,又被称为竞争性内源性RNA(Competitive Endogenous RNA,ceRNA)。近年来,ceRNA对疾病发生发展的研究受到广泛关注。本研究拟对circ-MFN2及circ-LDLRAD3在胰腺癌组织及胰腺癌病人血液中的表达情况入手,筛查胰腺癌新型诊断生物标志物。在此基础上,利用高通量测序技术筛查miRNA表达谱,通过扩大样本量验证目的miRNA,结合生物信息学分析及前期实验结果,在胰腺癌中筛查circ RNA—miRNA—mRNA调控网络,并验证此调控网络在胰腺癌发证发展中的作用及其潜在机制。研究方法:本研究首先选取了30例胰腺癌组织及其癌旁组织,31例胰腺癌病人血液与31例健康对照者血液,通过实时荧光定量聚合酶链式反应进行circ-MFN2和circ-LDLRAD3的表达验证,利用临床病理资料分析相关性并结合CA19-9联合分析两者作为胰腺癌潜在生物标志物的可能性。通过高通量测序技术筛查胰腺癌中miRNA的表达谱,扩大样本量验证后miR-133a-3p低表达并结合生物信息学分析,得出circ-MFN2—miR-133a-3p—SLC39A4调控网络。在胰腺癌原发癌细胞系BxPC-3,胰腺癌原发癌伴转移癌细胞系PANC-1,胰腺癌转移癌细胞系SW1990三株代表性细胞系中,首先通过核浆分离RNA明确circRNA的定位,过表达和敲减circ-MFN2,过表达和敲减miR-133a-3p,共转circ-MFN2和miR-133a-3p后,用CCK-8观察其对癌细胞增殖的影响,Transwell观察其对癌细胞侵袭的影响,细胞划痕实验察其对癌细胞迁移的影响,流式细胞术察其对癌细胞凋亡及细胞周期的影响,并通过蛋白质印迹实验检测凋亡与侵袭相关蛋白MMP9,MMP2,Timp-1,Cleaved Caspase-3的表达变化,综合观察不同情况下对癌细胞生物学行为的影响。利用双荧光素酶报告基因实验证明circ-MFN2与miR-133a-3p的结合,mi R-133a-3p与SLC39A4的结合,随后过表达和敲减SLC39A4观察其对下游MAPK/ERK通路、TGF-β/Smad信号通路的影响。结果:1.胰腺癌细胞、胰腺癌组织、胰腺癌病人血液中circ-MFN2和circ-LDLRAD3较之对照组高表达(P<0.01)。2.circ-MFN2与临床病理参数的关系中发现,circ-MFN2表达情况与肿瘤大小、临床分期及T分期相关;而circ-LDLRAD3表达情况与侵袭等因素相关。(P<0.01)。3.独立应用circ-MFN2作为诊断标志物的诊断效率,其受试者工作特征曲线下面积为0.73,临界值为10.9,敏感性为0.7377(0.6093-0.8420),特异性为0.6066(0.4731-0.7293)。联合CA19-9与circ-MFN2进行诊断效率检测发现,两者联合后,受试者工作特征曲线下面积增加到0.88,诊断敏感性及特异性分别提升至0.9766和0.9836。独立应用circ-LDLRAD3作为诊断标志物的诊断效率,其受试者工作特征曲线下面积为0.67,临界值为9.315,敏感性为0.5738(0.4406-0.6996),特异性为0.7049(0.5743-0.8148)。联合CA19-9与circ-LDLRAD3进行诊断效率检测发现,两者联合后,受试者工作特征曲线下面积增加到0.87,诊断敏感性及特异性分别提升至0.8033和0.9355。4.高通量测序结果及扩大样本量验证后发现,miR-133a-3p在胰腺癌细胞及组织中较之对照组低表达(P<0.01)。生物信息学分析显示,胰腺癌中可能存在circ-MFN2—miR-133a-3p—SLC39A4调控网络。5.过表达circ-MFN2后,对BxPC-3,PANC-1细胞增殖(P<0.01)、侵袭(P<0.01)、转移(P<0.05)能力增强,凋亡能力减弱(P<0.01),细胞周期S期增加,G0/G1期减少(P<0.01)。敲减circ-MFN2各种生物学行为与之相反。但这种效应在SW1990细胞系中不明显。6.过表达miR-133a-3p后对BxPC-3,PANC-1细胞增殖(P<0.01)、侵袭(P<0.01)、转移(P<0.05)能力减弱,凋亡能力增加(P<0.01),细胞周期S期减少,G0/G1期增加(P<0.01)。敲减circ-MFN2各种生物学行为与之相反。但这种效应在SW1990细胞系中不明显。7.circ-MFN2、miR-133a-3p及SLC39A4两两之间存在结合,且表达互相影响。8.共转circ-MFN2和miR-133a-3p后发现,两者之间存在负反馈调节,过表达miR-133a-3p后能逆转过表达circ-MFN2的生物学效应。这种效应在BxPC-3、PANC-1细胞系中较为显著,在SW1990细胞中不明显。9.SLC39A4能影响磷酸化MEK(P<0.01)、磷酸化ERK(P<0.01)、磷酸化Smad2/3(P<0.01)及Smad4(P<0.01)的表达。10.体外实验中,敲减circ-MFN2或过表达miR-133a-3p的BxPC-3及PANC-1细胞种瘤发现,肿瘤明显减缓生长(P<0.05);且共转敲减circ-MFN2和过表达miR-133a-3p的BxPC-3及PANC-1细胞系种瘤发现,肿瘤生长更加被抑制(P<0.05)。但在SW1990细胞系所种裸鼠未见明显肿瘤生长抑制。结论:1.circ-MFN2在胰腺癌细胞,组织及病人血液中高表达,且其表达情况与肿瘤大小密切相关,联合CA19-9可作为胰腺癌诊断的潜在生物标志物。circ-LDLRAD3在胰腺癌细胞,组织及病人血液中高表达,且其表达情况与侵袭、转移情况密切相关,联合CA19-9可作为胰腺癌诊断的潜在生物标志物。2.通过高通量测序及扩大样本量验证,在胰腺癌中发现miRNA-133a-3p低表达,生物信息学分析显示在胰腺癌中存在circMFN2—mi RNA-133a-3p—SLC39A4互作调控网络。3.Circ-MFN2在胰腺癌中起到促癌作用,miR-133a-3p在胰腺癌中起到抑癌作用,同时抑制circ-MFN2和升高miR-133a-3p能抑制胰腺癌的生长及生物学行为;SLC39A4能影响胰腺癌MAPK/ERK通路及Smad2/3/Smad4通路;circ-MNF2—miR133a-3p—SLC39A4调控网络在胰腺癌的发生发展中发挥重要作用,可能是胰腺癌治疗的潜在靶点。