在全球，每年癌症新发病例为1,270万，死亡病例为760万。而胃癌居我国恶性肿瘤发病率的第二位，死亡率的第三位。尽管这些年，早期筛查技术有所提升以及以手术治疗为主的综合防治措施的有了长足的改进，但胃癌根治性切除后5年转移复发率极高，其根本问题在于肿瘤的侵袭转移，因此胃癌侵袭转移机理研究及综合防治措施一直是肿瘤学界研究的重点。近年来，越来越多的研究显示肿瘤侵袭转移是一个多阶段、多因素逐级发展的渐进过程，不仅涉及癌细胞自身，也通过肿瘤微环境发生作用。因此，研究肿瘤侵袭转移必须从上述两方面入手。传统的肿瘤病理形态由于存在个体差异，判断误差较大，因此迫切需要发展分子病理以及基于分子病理的定量、半定量分析技术来准确分析肿瘤细胞的侵袭转移能力。另外，间质微环境成分众多，功能各异，现有的技术难以实现肿瘤组织中原位多个关键成分的共成像，因此迫切需要发展原位多分子共成像技术。量子点（Quantum dots, QDs）分子探针成像技术具有独特的表面和尺寸效应，激发光波谱宽、连续，紫外光可以激发任何大小的QDs；发射光波谱窄而对称；光稳定性好；荧光亮度强；荧光时间长，30-100ns；发射波长随QDs大小而改变等。近几年来，量子点探针技术与肿瘤分子标志物的有机结合，在分子成像、细胞成像和体内成像中取得了重大进步，作为一类新型纳米荧光探针，已经广泛用于肿瘤的分子靶向诊断研究。本课题基于胃癌的临床实践难题，从癌细胞分子病理生物学行为和肿瘤微环境两方面开展相关研究，结合量子点标记分子探针技术在肿瘤分子靶向诊断方面的应用优势，阐释胃癌侵袭转移过程中的癌细胞与微环境协同进化理论，为揭示胃癌侵袭转移机理奠定基础。第一部分：转化生长因子β1的表达与胃癌预后之间的关系研究目的：作为一个多功能的细胞因子，转化生长因子β (Transformgrowth factors beta, TGFβ)可通过蛋白激酶受体和SMAD介体途径，在肿瘤生长、侵袭和转移过程中，起着重要的作用。在正常情况下，TGFβ作为一个肿瘤抑制器，抑制细胞增殖、诱导凋亡和调节自噬。随着肿瘤的发展，TGFβ将会促进上皮间质转化和肿瘤细胞的运动、侵袭和转移。在世界范围内，胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其占癌症死亡的第三位。根据Lauren分级，胃癌可分为弥漫型和肠型两种。与肠型胃癌不同，弥漫型胃癌通常会伴随着间质纤维化，呈现弥漫性浸润生长，并且预后较差。TGFβ1是一个强有力的纤维化刺激因子，可为胃癌的播散创造一个适宜的环境。而且，在胃癌组织中，TGFβ1的高表达与胃癌的不良预后相关，特别是在弥漫型胃癌中。这些研究提示，TGFβ1或许在不同类型胃癌中具有不同作用。更重要的是，由于TGFβ1的分泌机制复杂，且具有双向功能，以前的研究或许不能准确地描述TGFβ1表达和患者预后之间的关系。因此，有必要探讨TGFβ1表达与不同临床病例亚组胃癌患者预后之间的关系。本文主要通过免疫组织化学染色方法，研究不同临床病理亚组胃癌的TGFβ1表达及其临床意义。研究方法：1.收集胃癌患者病例及相关资料：收集2002年12月至2011年1月期间接受以手术为主的多学科治疗的184例患者。由上海生物芯片有限公司，将184例胃癌肿瘤组织和41例癌旁组织制作成3张组织芯片(450个点，2个点/例)。为了控制TMAs的质量，仅选择可揭示肿瘤典型生物学行为的肿瘤侵袭前缘组织。根据第七版AJCC TNM分期系统和Lauren分类系统进行TNM分期和病理分类。至2012年5月31日，胃癌患者的中位随访时间为57.3月(范围：16.6-100.1)，108例患者发生了胃癌相关性死亡。2. TGFβ1的免疫组织化学染色：使用SP染色方法对组织芯片进行染色。染色过程简述如下：60℃常规烤片2h；二甲苯脱蜡3次，3min/次；梯度酒精如水；0.01mmol/L的磷酸盐缓冲液微波抗原修复20min；冷却至室温后，使用0.03%H2O2孵育10min，去除内源性过氧化氢酶；加入2%的BSA进行封闭30min，降低背景强度；每张组织芯片上加入250μL兔抗人的TGFβ1单克隆抗体，4℃过夜孵育；加入250μL小鼠抗兔的二抗37℃孵育30min；0.2%DAB显色2min；苏木素复染2min；5%的酒精分化5s；梯度酒精脱水。3.结果评估：由两位有经验的病理学专家对免疫组织化学染色结果进行评估。根据以前的报道，评分系统结合细胞染色强度和细胞染色比例，主要评分标准为：细胞染色强度分为无染色（0分）、轻度染色（1分）、中度染色（2分）和强染色（3分）；细胞阳性染色比例<10%为1级，细胞阳性染色比例10%-25%为2级，细胞阳性染色比例25%-50%为3级，细胞阳性比例>50%为4级。最终评分为染色强度评分和细胞阳性率评分的和。和为0-3分定义为低表达，4-6分定义为高表达。4.统计学分析：使用SPSS17.0软件进行统计学分析。用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验计算累计生存率，使用Pearson卡方检验进行相关性分析，使用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。P <0.05被认为具有统计学意义。研究结果：1.胃癌中TGFβ1的表达：TGFβ1在166(90.2%)例胃癌组织和33(80.5%)例癌旁组织中呈棕褐色表达。82(44.6%)例胃癌组织和28(68.3%)例癌旁组织中TGFβ1呈低表达，102(55.4%)例胃癌组织和13(31.7%)例癌旁组织中呈高表达。胃癌组织中TGFβ1表达要显著高于癌旁组织(χ2=7.554,P=0.006)。在某些患者中，可观察到TGFβ1在肿瘤间质和癌细胞中同时表达的现象。2. TGFβ1表达与临床病理参数之间的关系：老年患者中TGFβ1表达高于年轻患者(P=0.017)，肠型胃癌中TGFβ1表达高于弥漫型胃癌(P=0.015)。在其它临床病理参数之间，TGFβ1的表达差异无统计学意义，包括性别、肿瘤位置、浆膜侵犯、淋巴结转移情况、远处转移情况、复发情况及预后。3.临床病例参数与不同TGFβ1表达水平胃癌患者之间的关系：TGFβ1高表达与胃癌患者的不良预后相关(P=0.040)。Log-rank检验显示，弥漫型胃癌患者预后比肠型胃癌患者的预后差(P=0.018)。为了进一步确定TGFβ1和胃癌总生存之间的关系，我们将临床病例参数分为两个不同的亚组。在年轻患者、女性、弥漫型、低分化和淋巴结转移的胃癌中，TGFβ1高表达与不良预后相关。单因素分析显示，年龄、Lauren分类、病理分级、浆膜侵犯、淋巴结转移和TGFβ1表达水平与胃癌预后相关。多因素分析显示，年龄、病理分级、浆膜侵犯和TGFβ1表达水平是胃癌生存的独立预后影响因子。研究结论：本文探索了TGFβ1表达和胃癌预后之间的关系。结果表明，TGFβ1主要在胃癌的细胞膜和细胞质中表达，在胃癌组织中其表达水平显著高于癌旁组织。这一结果与以前的报道相似[18,22,26,30]。值得注意的是，在某些患者中，TGFβ1在胃癌细胞核和间质细胞中表达，从肿瘤微环境的角度来考虑，这或许具有重要意义。尽管研究已经证实TGFβ1高表达与不良预后相关（包括本文），但是以前的研究没有明确TGFβ1表达是否与其它临床病理参数相关。本研究显示，在我们研究的临床病理参数中，TGFβ1表达水平与患者年龄、胃癌类型相关。有趣的是，TGFβ1与上皮间质转化相关，纤维化是弥漫型胃癌的典型特征，但是本研究显示，肠型胃癌中TGFβ1表达高于弥漫型胃癌。因此，需要更多的研究来进一步确认胃癌中TGFβ1的双向功能和预后价值。而且，Cox多因素风险比例模型显示，TGFβ1表达、年龄、病理分级和浆膜侵犯是独立的预后因子。总之，本研究证实TGFβ1高表达与胃癌患者的不良预后相关，其高表达与年轻患者、女性患者、远端胃癌、低分化胃癌、弥漫型胃癌和淋巴结转移患者的不良预后相关。本文或许对TGFβ1治疗有一些启示，即在上述胃癌亚组中，抗TGFβ1的治疗或许更有效。第二部分：量子点标记分子探针技术研究胃癌侵袭微环境的多因素分析研究目的：胃癌是世界上第四大恶性肿瘤，居中国癌症死亡第三位。尽管这些年来，胃癌早期诊断及以手术为主的综合治疗方式有所改进，但胃癌患者的临床结局还是不乐观，其主要的问题在于肿瘤的侵袭转移。为了解决该难题，肿瘤学界在过去几十年里针对癌细胞开展了很多工作。最近肿瘤学界已经达成共识，肿瘤是一种免疫失衡的全身性疾病，不仅仅是单一肿瘤细胞的问题，而是全身细胞共同导致的问题。该理论的根基指引我们研究肿瘤不仅需要关注肿瘤细胞，还需要关注肿瘤微环境。因为，肿瘤微环境在肿瘤细胞与其微环境协同进化过程起了至关重要的作用。因此，我们迫切需要探讨肿瘤细胞及相关微环境的相互作用，以更好地揭示肿瘤侵袭转移的机制。在胃癌中，肿瘤微环境是一个复杂且动态变化的集体，在肿瘤侵袭过程中不断发生改变，包括肿瘤细胞从肿瘤原位逃逸，渗入血管或淋巴管，在血管中定居，或粘附至血管内皮细胞，渗出血管或淋巴管进入远处器官定居并增殖，伴随肿瘤新生血管生成，形成转移灶。在这个过程中，肿瘤微环境中的众多成分相互作用，共同促进肿瘤侵袭转移。主要包括炎性细胞，如巨噬细胞；免疫细胞，如T和B淋巴细胞；间质细胞如成纤维细胞和不同成熟度的肿瘤新生血管。这些成分在解剖及空间分布上需要满足一定的特征，才能共同促进肿瘤侵袭转移。最近研究表明，肿瘤细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管在空间分布上相互靠近，形成一个特定结构，称为肿瘤转移的微环境。因此，为了同时展现这些关键成分，迫切需要发展原位同时共成像技术，以更好阐释肿瘤侵袭机制。目前，能同时显示肿瘤组织切片上多种成分的技术很少。量子点，因其独特的尺寸和表面效应，在生物医学领域应用中展现出巨大的潜力。本研究利用量子点标记分子探针多色成像的技术，研究肿瘤细胞与巨噬细胞和肿瘤新生血管的相互作用关系，发展一种基于计算机辅助计算肿瘤侵袭单元的技术。研究方法：1.收集胃癌患者病例资料及病理标本：通过建立和济医院2008-2012年的胃癌标本数据库，从中选择30例胃癌患者标本作为试验数据集，另外选择一组独立的60例胃癌患者标本作为验证数据集，完善相关的临床病理信息，及病理标本收集。2.基于量子点的肿瘤组织双色成像：上述收集的标本病理切片后，采用量子点标记分子探针技术原位双分子染色，对胃癌组织中的巨噬细胞及肿瘤新生血管进行原位共成像。3.图像采集及肿瘤侵袭单元计算：量子点双分子成像后，在荧光显微镜及多光谱分析软件下采集荧光图像，利用多光谱分析软件对巨噬细胞以及肿瘤新生血管的成像结果进行信号分离，在计算机辅助的图像处理技术辅助下，计算肿瘤侵袭转移单元数目。4.统计分析：所有的统计分析均在SPSS21.0软件中完成。研究结果：1.肿瘤进展过程中肿瘤侵袭单元呈现两种不同的表现形式：在第一种类型中，肿瘤新生血管为纵向分布。多角形肿瘤新生血管在各个渗出的角中都伴随着巨噬细胞的浸润。另外，还能看到巨噬细胞浸润肿瘤新生血管，一半在血管外，一半在血管内。另一种类型的肿瘤侵袭单元中血管成横向分布，巨噬细胞可以分布在血管周围，靠近血管；也可以穿透血管，还可以在血管内定居。上述两种不同形态的肿瘤侵袭单元，以及肿瘤新生血管与巨噬细胞的动态变化，共同促进肿瘤侵袭转移。2.肿瘤侵袭单元与患者病理特征的关系：不同分化程度的胃癌患者的肿瘤侵袭单元数量不同，并且高分化管状腺癌、低分化管状腺癌及印戒细胞癌三组间的肿瘤侵袭单元具有显著性差异。首先，低分化组的巨噬细胞密度（1544）显著高于高分化组（317）和印戒细胞癌组（1011）。肿瘤新生血管的统计结果与肿瘤巨噬细胞的统计结果相似。低分化组的肿瘤新生血管密度最高（789），显著高于高分化组（474）和印戒细胞癌组（774）。并且，低分化组的肿瘤侵袭单元（373）显著高于低分化组（82）和印戒细胞癌组（177）。因此，这组试验数据集的结果提示肿瘤侵袭单元在三组之间有显著差异。3.肿瘤侵袭单元与临床预后的关系：验证数据集中60例患者的平均年龄为60.7岁，女性患者为41例，男性患者为19例，高分化管状腺癌为20例，低分化管状腺癌为23例，印戒细胞癌患者为17例，肿瘤未浸润至浆膜的为14例，浸润至浆膜及以外的为46例，无淋巴结转移的为18例，有淋巴结转移的为42例，无远处转移的为53例，有远处转移的为7例，肿瘤分期为早期的是21例，晚期的为39例，50例患者行根治性胃大部切除手术，10例患者为根治性胃全切手术，20例患者进行了术后化疗，另外40例未进行术后化疗，60例患者的总体生存期为17.8月。生存分析数据显示：肿瘤巨噬细胞密度和肿瘤侵袭单元是胃癌患者预后的独立预后因子，肿瘤新生血管不是独立的预后因子。肿瘤巨噬细胞数量越多，肿瘤侵袭单元越多，胃癌患者的预后越差。ROC工作曲线表明肿瘤侵袭单元的曲线下面积最大（63.2%），提示相较于巨噬细胞而言，肿瘤侵袭单元的独立预后预测效能更高。4.肿瘤侵袭单元对患者预后影响：为了更进一步证实，我们选择6个案例来做进一步阐述，3例是有相同临床TNM分期和临床治疗方式的低分化管状腺癌，3例是有相同临床TNM分期和临床治疗方式的高分化管状腺癌。深入分析上述几个案例，可以发现具有相同临床TNM分期及临床治疗策略的肿瘤患者，肿瘤侵袭单元数量越多，患者的总体生存期越短。3例低分化管状腺癌中，每200个高倍视野的肿瘤侵袭单元数量分别为7个，20个和58个，其对应的总体生存期分别为20.6月，11.1月和3.3月。另外的3例高分化管状腺癌中，每200个高倍视野的肿瘤侵袭单元数量分别为3个，11个和24个，其对应的总体生存期分别是42.6月，27.6月和14.3月。研究结论：上述研究结果表明肿瘤细胞和肿瘤微环境的相互作用对胃癌患者的临床结局有显著影响。具体而言，肿瘤细胞和其周围微环境中的新生血管和浸润性巨噬细胞形成在空间分布上的结构，即肿瘤侵袭单元，促进肿瘤侵袭转移。肿瘤组织中肿瘤侵袭单元的数量与患者的预后及肿瘤分化程度呈负相关。另外，肿瘤侵袭单元的预后预测效能比单一的肿瘤微环境成分高。更有趣地是，我们发现肿瘤新生血管密度并不是胃癌患者预后的独立生存因子。这提示我们肿瘤新生血管对肿瘤进展的影响可能是受巨噬细胞调控的，这也同样证实了肿瘤侵袭单元的有效性。量子点标记分子探针技术及多光谱分析技术对这项研究有突出贡献。量子点是一类具有独特的光学特性的纳米分子，在生物医学领域有广泛的应用前景。相较于传统的荧光染料和蛋白而言，量子点有独特的尺寸和表面效应。量子点具有显著的成像优势，包括组分可调性成像，荧光强度更高，抗漂白能力更强。另外，不同颜色的量子点能在相同波长的紫外光下激发，且光谱重叠窄，这使得其在多分子靶向原位成像技术中展现出突出的优势。正是这一特性，使得量子点很适合用于肿瘤侵袭单元的研究。在本研究中，巨噬细胞和肿瘤新生血管同时标记为绿色和红色。因此，相较于传统的人工合成不同激发光下的成像图片，这种基于量子点标记分子探针技术的成像技术真正实现了原位多分子共成像，可用于更好地研究肿瘤组织多种成分的相互作用。肿瘤转移和复发是胃癌治疗失败的根本原因，肿瘤细胞侵袭是肿瘤发生远处转移的第一步，也是最重要的一步。目前，还没有合适的技术能预测肿瘤侵袭转移的风险。本研究结合量子点标记分子探针多色成像技术的优势，对肿瘤侵袭单元的成分包括肿瘤细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管进行成像，分析其空间分布关系，发展了计算机辅助的图像处理技术和算法。结果显示肿瘤侵袭单元具有较高的预测效能，再次证实了量子点标记分子探针原位多分子共成像技术在肿瘤多参数整合研究中的优势。