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牛疙瘩皮肤病(Lumpy skin disease,LSD)是牛的一种急性、亚急性传染病,由痘病毒科(Poxviridae)羊痘病毒属(Capripoxvirus,CPV)的牛疙瘩皮肤病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)引起。主要临床特征为病牛发热、皮肤表面出现大量疙瘩,致使牛的生产力下降,皮张鞣制后出现凹陷或孔洞,造成严重的经济损失,影响国际贸易和养牛业的发展。因此,OIE将其定为必须通报疫病,我国也将其定为进境动物一类传染病。该病在撒哈拉和马达加斯加等非洲国家和地区呈地方流行,近年来该病有向世界各地蔓延的趋势,目前已威胁到欧洲、中东和亚洲地区,其中,与我国毗邻的越南疫情较为严重。为防止该病传入我国,有必要建立并储备LSD监测方法和进行疫苗相关研究。本试验主要对LSDV-ORF132基因进行克隆表达,并对其二级结构、抗原性和功能等做了初步的预测和分析。主要研究结果如下:1.牛疙瘩皮肤病毒ORF132基因的克隆LSDV 与山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)、绵羊痘病毒(Sheep pox virus,SPPV)基因组间的同源性非常高,但ORF132基因是与毒力和宿主范围有关的LSDV独有基因,其编码蛋白与其他已知蛋白缺少同源性。本试验采用原代羔羊睾丸细胞对南非LSDV弱毒株疫苗进行增殖培养,参照GenBank公布的Neethling vaccine LW1959株LW132编码序列设计带EcoR Ⅰ、BamHⅠ酶切位点的特异性引物,以病毒DNA为模板,通过常规PCR方法扩增目的基因LSDV-ORF132,将扩增产物经胶回收纯化后克隆至pMD-19-T克隆载体中,进行测序分析。试验结果显示:LSDV感染的原代羔羊睾丸细胞内出现胞浆内包涵体,接种24h后,细胞培养物内出现结节状聚集。PCR扩增出LSDV-ORF132原核表达片段,大小约542bp。测序结果表明LSDV-ORF132基因由534个核苷酸组成,GC含量为25.7%。与参照序列Neethling vaccine LW1959(AF409138)株LW132基因同源性为99%,在LSDV各毒株间高度保守,而与同属的GTPV和SPPV相应基因同源性低,具有较高的特异性,可作为生物标记用于羊痘病毒属LSDV、GTPV和SPPV的分子鉴别。2.LSDV-ORF132基因编码蛋白的生物信息学LSDV-ORF132基因编码177个氨基酸,蛋白分子量约为20.63 kD,其不溶性氨基酸残基为59.8%,表达形式疑为包涵体。采用丹麦Tekniske大学序列分析中心提供的在线分析工具和DNAStar的Protein模块进行信号肽、跨膜区、二级结构、亲水性、柔韧性、抗原指数的分析、B细胞表位预测,进行功能预测。结果表明:该蛋白无信号肽;肽链N端第4～21位的疏水氨基酸残基构成跨膜区;主要有3 个a-螺旋,7个β-螺旋,6个转角,无规则卷曲分别较散,没有形成大的区域;蛋白分子整体亲水性较好、柔韧性区域分布均匀、表面可及性较高,抗原指数较高的区域在 22-27,634-50,55-66,71-81,85-91,96-101,108-115,120-115,163-171区段上;B细胞抗原表位在35-42,61-65,71-76,95-99,107-114,120-125区段上。编码蛋白LSDV-ORF132用BLASTP搜索羊痘病毒属蛋白质数据库,结果表明LSDV与同属的山羊痘和绵羊痘处于明显不同的分支。从特异性和线性表位预测考虑,LSDV-ORF132 为筛选高效表达的理想抗原候选,将山羊痘和绵羊痘病毒得到良好区分,进而为进行诊断、免疫预防和治疗等方面的研究提供依据。3.LSDV-ORF132基因编码蛋白的原核表达通过设计的带EcoRⅠ、BanH Ⅰ酶切位点的引物,经PCR扩增出原核表达片段LSDV-ORF132基因,用双酶切、连接的方法将目的基因插入原核表达载体pGEX-6p-1、pET-32-a(+)中,从而构建重组表达载体pGEX/pET-ORF132。将重组表达载体转入工程菌JM109中,其重组菌经PCR、双酶切和测序鉴定后,将鉴定为阳性的重组表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)中进行原核表达,经IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达了蛋白分子量为47.45 kD和39.97 kD的蛋白。采用半干法将SDS-PAGE中蛋白条带转移至PVDF膜上,用鼠源GST/His标签抗体(1:1000)为一抗,兔抗鼠IgG-HRP(1:2000)为二抗,DAB为显色液进行Western blot。结果显示二个重组蛋白分别在47.45 kD和39.97 kD处有明显的显色带,表明二个重组蛋白可以作为抗原分别被抗GST单克隆抗体和抗His单克隆抗体识别,具有较好的反应抗原性,LSDV-ORF132可作为候选抗原,为诊断试剂的开发以及研制更有效、更安全的疫苗提供材料。