背景及目的：西班牙神经解剖学家Santiago Ramóny Cajal1893年用甲基蓝和嗜银染色法在胃肠道神经系统中观察到一类非神经但与神经有关的特殊间质细胞，并对该细胞进行了比较详细的描述，由于这群特殊细胞介于神经末梢与平滑肌肌肉之间，所以被命名为Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal，ICC）。在随后的一个多世纪中，伴随着实验技术的蓬勃发展，对胃肠道ICC细胞研究也不断深入。目前发现的胃肠道ICC主要功能包括：①ICC作为胃肠道中的“起搏细胞”，产生自发节律性慢波（slow waves，SW）电位，并通过ICC细胞网络结构同步传导至周围平滑肌细胞（smooth muscle cells,SMC）,激活SMC的电压依赖Ca²⁺通道后，产生动作电位（action potential, AP）和胃肠道平滑肌蠕动；②ICC位于胃肠神经与SMC之间，它们介导神经递质信号传递至SMC，参与神经支配的胃肠道运动的调节。目前已发现ICC对乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）、一氧化氮（Nitric Oxide NO）、血管活性肠肽（vasoactive intestinal polypeptide, VIP）、三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）、P物质（substance P, SP）等肠神经递质均有反应，并可能参与介导这些递质对平滑肌舒缩效应；③ICC的其他的功能，如免疫调节、生长、修复、纤维化以及参与某些胃肠道疾病病理改变的过程。NO是调节胃肠道运动的重要抑制性神经递质，主要由一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase, NOS）在自主神经末梢内催化L-精氨酸产生，由于NO自身带有一个自由基，它能迅速弥散进入靶细胞。NO神经递质与胃肠壁SMC细胞内可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase, sGC）的两个亚基sGCα、sGCβ结合后被活化，活化的sGC催化3,5-三磷酸鸟苷形成环磷酸鸟苷（cyclic guanosine3′,5′-monophospate, cGMP），后者激活cGMP依赖蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinases, PKG），激活后的PKG磷酸化目标蛋白，包括离子通道、离子泵和参与调控胞内Ca²⁺水平的酶，从而降低SMC细胞内Ca²⁺浓度，抑制胃肠道SMC兴奋、导致胃肠平滑肌松弛效应。此前的研究发现胃肠道ICC在介导NO神经递质信号传递至SMC过程中扮演重要的中介角色。Nelson G等人最早报道结肠内ICC细胞可放大NO神经递质对平滑肌的松弛效应。作者认为NO作用于平滑肌间的ICC细胞后，升高ICC细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]i)，随后导致NO的进一步释放和[Ca²⁺]i进一步升高，这一正反馈效应放大了神经递质NO对平滑肌的抑制效应。最近文献报道中相继提供了大量形态学和功能学的证据，证实了胃肠道ICC细胞在参与调节胃肠道NO/cGMP/PKG信号通路中重要作用。这些证据主要包括：①ICC上表达比SMC更为丰富的NO递质分子的靶蛋白sGC，表明胃肠道ICC是NO的靶细胞；②功能免疫组化实验结果显示刺激神经释放的NO以及外源性NO均可使胃肠道ICC细胞内cGMP升高，而胃肠道SMC对外源性的NO作用效应不明显；③在用c-kit突变的W/WV大鼠实验发现，NO神经递质对离体平滑肌条的松弛作用明显减弱；④ICC上表达nNOS，结合Nelson G等人的发现推测nNOS的表达可能ICC介导神经信号传递过程中信号转换相关；⑤ICC与附近的nNOS免疫阳性的神经末梢形成类似触突的紧密联系，而SMC与自主神经之间不形成直接联系。综合目前的研究发现，胃肠道ICC可能通过两种方式参与介导触突后NO神经递质信号传导机制：①NO神经递质在自主神经末梢由nNOS催化下合成并释放，通过类似触突连接作用于ICC细胞内丰富的sGC，活化的sGC在胞浆内催化形成大量的cGMP，后者激活PKG，随即引出细胞反应，其中电生理效应通过ICC与SMC之间的缝隙连接蛋白通道传递至SMC，引发后者超级化和膜电位的稳态，消弱平滑肌细胞对兴奋递质的收缩效应或产生平滑肌松弛效应；②ICC细胞内具有NO合成酶nNOS，NO神经递质作用于ICC细胞的sGC受体蛋白后，可通过某种机制导致ICC细胞内Ca²⁺浓度增加以及NO或其类似物合成并释放，作用于SMC，从而放大神经递质NO对SMC的抑制效应。在阴茎勃起机制中，NO/cGMP/PKG信号通路是调节阴茎海绵体平滑肌松弛及阴茎勃起最重要的机制。传统观点认为非胆碱非肾上腺素能（non-adrenergicnon-cholinergic NANC）神经末梢及内皮细胞合成NO分子，在海绵体内，NO直接作用于血管及海绵窦SMC细胞膜上可溶性GC后，通过NO/cGMP/PKG信号传递通路最终导致海绵体平滑肌舒张和阴茎勃起效应。但是NO神经递质诱导的阴茎勃起机制目前并未完全阐述清楚，除外NO对SMC的直接作用方式，在海绵体内是否存在NO递质其他的信号传递途径目前尚不清楚。在人、豚鼠等物种的阴茎海绵体组织都发现了c-kit免疫阳性的ICC细胞存在。形态学和电生理研究已证实海绵体ICC并非SMC电活动的起搏细胞，其主要作用可能是通过介导神经递质的信号传递调节海绵体平滑肌运动。此前的研究发现海绵体平滑肌的自发性收缩可分别被消炎痛或NS398（COX-2环氧酶的抑制剂）抑制或消弱，而海绵体ICC上COX-2免疫强阳性，但SMC上COX-2免疫阳性非常弱，因此推测海绵体ICC作为中介，可能参与了体内释放的前列腺素对海绵体平滑肌自发性收缩的调节。病理学研究也发现阴茎勃起功能障碍（erectile dysfunction ED）患者海绵体组织中，ICC细胞数量明显减少，所以推测这可能与ED的发病相关。综上所述，目前阴茎海绵体ICC的研究尚处在起步阶段，基于胃肠道ICC在介导NO神经递质信号传递中的重要作用以及阴茎海绵体ICC已知的研究发现，本课题拟从形态学和功能两个方面探讨阴茎海绵体ICC参与介导NO神经递质调节平滑肌舒张效应的可能，即NO神经递质-->ICC-->SMC信号传递途径。这将为进一步探讨阴茎勃起的生理机制及ED发病机制研究提供一个全新的切入点。材料与方法：1.本研究以6-8月龄健康雄性豚鼠为研究对象，通过阴茎海绵体免疫组化实验观察ICC细胞的形态和分布特点；2.通过透射电镜实验观察阴茎海绵体内ICC的超微结构特征以及ICC与周围神经和SMC的关系，为ICC功能研究提供形态学的证据；3.通过流式细胞技术建立可以用作分子生物学研究的分选ICC细胞的方法，为后续ICC功能研究做准备；4.通过Western Bloting和免疫荧光组织化学实验检测阴茎海绵体ICC细胞上NO受体蛋白的表达，验证海绵体ICC成为神经递质NO靶细胞的可能；5.通过免疫荧光组织化学实验检测NO神经递质信号传递下游分子PKG、nNOS表达，推测海绵体ICC介导NO神经递质调节平滑肌舒张效应的可能机制。结果：1.成年雄性豚鼠阴茎海绵体组织切片c-kit免疫组化染色可见豚鼠阴茎海绵体内存在典型的c-kit阳性的ICC细胞，细胞呈纺锤形或长梭形有突起，大小约40nm–110nm（63.7±24.2nm），主要散在分布于平滑肌细胞周围和，血管或海绵窦内皮下，相互间缺乏联系，不能形成ICC网络状结构；2.透射电镜观察成年雄性豚鼠阴茎海绵体ICC细胞的超微结构，低倍镜发现多为梭形，狭长的两极向不同方向延展，并分布在SMC细胞周围以及血管、海绵窦内皮下，高倍镜下显示在ICC细胞内一个椭圆形的单核位于胞浆的中央；周围胞浆内观察到丰富的线粒体、滑面内质网、致密斑、以及丰富的凹陷小泡沿胞膜内壁分布，偶见溶酶体出现在胞浆内，中间丝、微管、细丝以及糖原成分在胞浆内不明显，此外发现ICC与阴茎海绵体内无髓鞘神经关系密切，常位于神经纤维周围，并且海绵体ICC细胞与周围的SMC之间形成缝隙连接结构；3.成功构建了通过流式细胞技术建立可以用作分子生物学研究的分选海绵体ICC细胞的方法；4. Western Bloting和免疫荧光组织化学实验证实了豚鼠阴茎海绵体ICC细胞上NO受体sGC的两个亚基sGCα1、sGCβ1的表达；5.免疫荧光组织化学实验证实了豚鼠阴茎海绵体c-kit免疫阳性的ICC细胞上NO神经递质作用的下游信号分子PKG、nNOS的表达。结论：1.豚鼠阴茎海绵体ICC形态学研究发现ICC形态、分布、超微结构特点、与周围组织细胞的关系。海绵体ICC呈纺锤形或长梭形有突起，散在分布于平滑肌间及内皮下，彼此不构成相互连接的网络结构；透射电镜观察海绵体ICC发现其超微结构与胃肠道ICC类似，且海绵体ICC位于神经组织周围，与毗邻的SMC形成缝隙连接，形态学结果为ICC功能研究提供了结构基础；2.利用流式细胞技术成功分选出可用作分子生物学研究的高纯度豚鼠阴茎海绵体ICC细胞，为以后ICC分子生物学研究建立了一种简单、可行的细胞分选办法；3.豚鼠阴茎海绵体ICC功能学研究发现ICC细胞上表达NO分子敏感的受体蛋白sGC以及nNOS、PKG蛋白，结果提示海绵体ICC是NO神经递质的靶细胞，氮能神经释放的NO递质作用于海绵体内ICC后，可能类似于胃肠道ICC，通过ICC细胞内进一步合成并释放NO分子作用于周围SMC或通过活化ICC细胞内的PKG，引起ICC细胞电位变化，通过缝隙连接传递给SMC调节海绵体平滑肌舒缩运动。