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目的采用高效液相色谱法(HPLC)测定急性铊中毒犬经不同方法治疗后血浆中谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)以及脑组织中兴奋性、抑制性氨基酸含量的变化,进一步探究体内铊与巯基结合,引起脂质过氧化以及神经毒性损害的机制,为急性铊中毒治疗提供理论依据。方法1、动物模型：24只比格犬随机分成4组,雌雄各半(n=6),分别为染毒对照组、普鲁士蓝治疗组(PB)、血液灌流治疗组(HP)以及普鲁士蓝联合血液灌流治疗组(PB+HP),各组均给予硝酸亚铊(TINO3)半数致死剂量(LD50=45mg/kg)灌胃染毒,对照组染毒后不做任何处理；PB组于首次染毒后4小时给予普鲁士蓝灌胃,剂量为467mg/kg/d,分3次,连续5日；HP组染毒后4小时开始进行血液灌流,每次2小时,每日1次,连续5日；PB+HP组染毒后4小时给予PB组联合HP组的处理方式；期间观察动物体重,精神状态,饮食情况变化,10日后处死,分离并留取不同脑区脑组织。2、高效液相色谱法测定血浆中谷胱甘肽及半胱氨酸的含量：4组动物分别进行染毒前及染毒后1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h、192h、216 h、240 h采血1 ml,冰浴,立即离心,取上清,以青霉胺为内标,DTNB为衍生化试剂,衍生化处理后,采用高效液相色谱—紫外(HPLC-UV)法,色谱柱为ZORBAX SB-C 18(4.6×250 nm,5 μm),流动相：A 0.05 mol/L乙酸钠缓冲液(pH=5.6)-甲醇(90：10)；B甲醇-水(90：10),甲醇梯度洗脱,流速：1 ml/min,柱温30℃,检测波长：320 nm,检测血浆中谷胱甘肽和半胱氨酸的含量,剩余血浆置于-79℃,以便日后测定。3、高效液相色谱法测定脑组织中兴奋性及抑制性氨基酸的含量：观察10日后麻醉处死动物,分别取脑组织的皮质、纹状体、海马、下丘脑、小脑及脑干各0.1 g,按质量／体积之比1：10加入0.1 mol/L的高氯酸,匀浆机冰浴匀浆后加入冷冻离心机(4℃,16000 r,15min),离心后取上清液500 μl,用1 mol/L的氢氧化钠将组织液调pH=9,定容至1ml,以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂,采用高效液相色谱—荧光(HPLC-FLU)法,色谱柱为ZORBAX SB-C18(4.6×250 nm,5 μm),流动相为B 0.1 mol/L磷酸二氢钠-0.5mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(用磷酸调至pH=4.5)：甲醇(85：15),A纯乙腈；乙腈梯度洗脱,流速1 ml/mm,柱温26-C,波长：230/450 nm,荧光检测器检测脑组织中兴奋性及抑制性氨基酸含量。结果建立高效液相色谱法测定血浆中谷胱甘肽及半胱氨酸模型,GSH、Cys及青霉胺分别在2.9 min.4.0 min及9.0 min被分离出,峰型良好,分离度高。GSH在0.714～14.286 μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=15.153X+8.043,相关系数为0.9993；稳定性试验RSD<7.61%；日内精密度<8.422,日内回收率100.38%-103.47%；日间精密度<8.518%,日间回收率98.16%-104.11%。Cys在0.714～14.286μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=17.813X+653.89,相关系数为0.9994；稳定性试验RSD<8.01%；日内精密度<5.965%,日内回收率97.41%-101.48%；日间精密度<7.611%,日间回收率99.79%-108.68%。建立高效液相色谱法测定脑组织中Asp、Glu、Gly及GABA模型,Asp、Glu、Gly及GABA分别在3.5 min、5.0 min、5.6 min及18.4min被分离出,峰型良好,分离度高。Asp在25-500μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=373.95X+3654.60,相关系数为0.9998；稳定性试验RSD<8.965%；日内精密度<7.526%,日内回收率99.68%-105.69%；日间精密度<7.806%,日间回收率94.78%-97.33%。Glu在25-500μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=343.83X+1575.80,相关系数为0.9994；稳定性试验RSD<6.512%；日内精密度<7.308%,日内回收率97.80%-101.50%；日间精密度<7.599%,日间回收率95.50%-107.50%。Gly在25～500 μg/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=989.64X+4972.90,相关系数为0.9995；稳定性试验RSD<5.793%；日内精密度<5.653%,日内回收率98.57%-107.67%；日间精密度<6.632%,日间回收率98.23%-104.64%。GABA在25-500 μ/ml范围内,线性良好,标准曲线方程为Y=697.23X+4612.40,相关系数为0.9997；稳定性试验RSD<7.925%；日内精密度<8.018%,日内回收率98.86%-109.46%：日间精密度<8.890%,日间回收率92.66%-104.34%。急性铊中毒染毒对照组、PB组、HP组及PB+HP之间,血浆GSH及Cys浓度均存在差异,主体内效应检验P值均<0.05,说明不同时间点GSH及Cys浓度依据分组不同存在差异；主体间效应检验P值均<0.05,说明各治疗组与对照组之间GSH以及Cys浓度存在统计学差异,其中普鲁士蓝联合血液灌流组下降最为明显。PB组、HP组及PB+HP组与染毒对照组比较,皮层、下丘脑及海马区Asp及Glu含量存在差异,P值均<0.05,其余脑区无明显变化。PB组、HP组及PB+HP组与染毒对照组比较,各脑区抑制性氨基酸含量变化不明显。结论本实验建立的HPLC测量血浆GSH及Cys含量方法及HPLC测量脑组织中Asp、Glu、Gly及GABA方法精确灵敏,稳定性高,可用于铊中毒犬血浆中GSH、Cys及脑组织中四种氨基酸的快速检测。犬急性铊中毒后血浆GSH及Cys均出现明显下降,经PB、HP及二者联合治疗后下降程度降低,PB+HP组最为明显。急性铊中毒犬各脑区EAA及IAA含量不等,犬经PB、HP及二者联合治疗后,皮层、下丘脑及海马EAA含量较中毒对照组均有所下降,PB+HP组下降最为明显,IAA无明显变化。综合分析提示GSH、Cys与EAA在急性铊中毒致病机制中发挥一定的作用,PB、HP及PB+HP治疗均有效,PB+HP效果最为明显,可能是救治急性铊中毒最为理想的手段。