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目的:研究转录因子MRTF-A诱导自噬缓解脑缺血再灌注大鼠神经细胞损伤的相关分子机制。方法:1、慢病毒感染脑室最佳条件摸索:(1)35只SD大鼠随机均分为7组:对照组,高表达5、7、9天组,抑制表达5、7、9天组。按1.6×10~6TU/只注射剂量,对照组注射慢病毒空载体,高表达组注射高表达MRTF-A慢病毒,抑制表达组注射抑制表达MRTF-A慢病毒。注射后分别在第5、7、9天取脑组织,Western blot检测MRTF-A表达水平,确定慢病毒感染脑室的最佳时间。(2)20只SD大鼠随机均分为4组:对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。对照组注射慢病毒空载体(1.6×10~6TU/只),低、中、高剂量组分别按0.8×10~6TU/只、1.6×10~6TU/只、2.4×10~6TU/只注射高表达MRTF-A慢病毒。7天后取脑组织做冰冻切片,观察MRTF-A的荧光表达水平,确定慢病毒注射最佳剂量。(3)20只SD大鼠随机均分为4组:对照组、P1组(前囟后1.72mm,矢状缝旁开1mm,深度2.6mm)、P2组(前囟后1.72mm,矢状缝旁开2mm,深度2.6mm),P3组(前囟后0.72mm,矢状缝旁开2mm,深度2.6 mm),每组按1.6×10~6TU/只剂量注射高表达MRTF-A慢病毒,7天后取脑组织做冰冻切片,观察MRTF-A的荧光表达范围,确定慢病毒最佳注射位点。2、MRTF-A对脑缺血再灌注损伤的影响:80只SD大鼠随机均分为4组:假手术组、脑缺血再灌注模型组、高表达MRTF-A组和抑制表达MRTF-A组。按1.6×10~6TU/只注射剂量,假手术组注射慢病毒空载体,高表达组注射高表达MRTF-A慢病毒,抑制表达组注射抑制表达MRTF-A慢病毒。慢病毒注射7天后采用大脑中动脉栓塞法构建脑缺血2h再灌注24h模型。(1)利用Western blot检测MRTF-A蛋白表达水平;(2)Longa’s 5分法进行神经功能评分,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色评价脑梗死体积;(3)干湿重法测定脑含水量;(4)HE染色观察脑组织形态学变化;(5)透射电镜观察大脑皮层和海马CA3区细胞超微结构改变。以此确定MRTF-A对神经损伤的影响。3、MRTF-A调控神经细胞自噬与抑制脑缺血再灌注损伤的相关性40只SD大鼠随机均分为4组:假手术组、脑缺血再灌注模型组、高表达MRTF-A组和抑制表达MRTF-A组。按1.6×10~6TU/只注射剂量,假手术组注射慢病毒空载体,高表达组注射高表达MRTF-A慢病毒,抑制表达组注射抑制表达MRTF-A慢病毒。慢病毒注射7天后采用大脑中动脉栓塞法构建脑缺血2h再灌注24h模型。(1)利用透射电镜观察皮层及海马CA3区自噬溶酶体的形成;(2)利用Western blot检测自噬相关蛋白(Beclin-1,ATG5、LC3Ⅱ/I、p62)表达水平,自噬信号通路相关蛋白(pAKT/AKT,pULK1/ULK1,pmTOR/mTOR)表达水平,以此探讨MRTF-A调控自噬的具体分子机制。结果:1、慢病毒感染脑室最佳条件:(1)确定慢病毒在注射后第7～9天可有效上调或抑制MRTF-A表达,与对照组相比,具有统计学意义(P<0.05)。(2)确定慢病毒在注射后第7天扩散至全脑,且最佳注射剂量为1.6×10~6TU,与对照组相比,具有统计学意义(P<0.05)。(3)确定最佳注射位点为前囟后1.72mm,矢状缝旁开2mm,注射深度2.6mm。与对照组相比,具有统计学意义(P<0.01)。2、MRTF-A可有效抑制脑缺血再灌注介导的神经损伤:(1)检测脑损伤、脑梗死体积和脑水肿情况,结果发现:与对照组相比,构建脑缺血再灌注模型后,缺血侧出现明显梗死体积和脑水肿症状,神经功能缺损严重(P<0.01);相比模型组,高表达MRTF-A显著降低神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量(P<0.05);而抑制MRTF-A后神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量显著升高(P<0.05)。(2)观察神经细胞超微结构改变,发现:脑缺血再灌注模型介导的损伤主要发生在大鼠大脑的皮层区、海马CA3区,表现为脑组织结构紊乱、神经细胞核皱缩浓染,生成大量坏死细胞,核膜、核周细胞器及突触形态和结构异常,细胞器肿胀变形。当高表达MRTF-A时,可显著缓解神经细胞结构的异常改变,抑制MRTF-A则进一步加深损伤。3、MRTF-A诱导神经细胞自噬抑制脑缺血再灌注损伤:(1)观察神经细胞超微结构发现:构建脑缺血再灌注模型后,神经细胞核周自噬溶酶体数量与对照组无显著差异(P>0.05);相比模型组,在高表达MRTF-A的神经细胞超微结构中发现了大量的自噬溶酶体(P<0.05);抑制MRTF-A组核周自噬溶酶体形成数量变化无显著差异(P>0.05)。(2)检测自噬相关蛋白表达发现:与对照组相比,构建脑缺血再灌注模型后,自噬相关蛋白Beclin-1,ATG5、LC3Ⅱ/I表达水平稍升高,P62表达水平稍降低,但无统计学差异(P>0.05);当脑组织高表达MRTF-A时自噬蛋白Beclin-1,ATG5、LC3Ⅱ/I表达水平相比模型组显著升高(P<0.05或P<0.01),P62表达水平显著降低(P<0.05);当抑制MRTF-A时Beclin-1,ATG5、LC3Ⅱ/I表达水平相比模型组显著降低(P<0.01),而P62表达水平则显著升高(P<0.01)。(3)检测自噬相关信号通路活性发现:模型组m TOR、AKT、ULK1蛋白磷酸化水平与假手术组无显著性差异(P>0.05);当脑组织高表达MRTF-A时mTOR、AKT蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),ULK1磷酸化水平显著升高(P<0.05);当抑制MRTF-A时则呈现相反现象(P<0.05 or P<0.01)。结论:1、本研究构建的过表达MRTF-A和抑制表达MRTF-A慢病毒,可有效感染全脑达到有效剂量,并用于后续研究。2、在脑缺血再灌注模型上,MRTF-A可通过减少梗死体积、缓解神经细胞损伤、增强自噬水平有效抑制脑缺血再灌注损伤,而抑制MRTF-A表达后则加重脑损伤。提示:MRTF-A可有效抑制脑缺血再灌注介导的神经损伤。3、缺血区过表达MRTF-A可显著上调自噬蛋白Beclin-1,ATG5、LC3II/I表达,下调P62表达,诱导自噬发生;同时通过PI3K/AKT-mTOR-ULK1信号通路促进自噬水平升高。说明:MRTF-A的神经保护作用与诱导自噬水平升高有关。