论文部分内容阅读
研究背景乳腺癌是全世界女性最常见的肿瘤,与此同时也是导致癌症相关性死亡的第二大癌症。约20%的乳腺癌患者过表达人类上皮细胞生长因子受体2(human endothelial receptor 2,HER2),HER2 是一种 185KDa 酪氨酸激酶受体,它由位于17号染色体上的原癌基因编码。HER2过表达又和药物治疗抵抗、疾病的复发和预后不良相关。尽管各种靶向治疗药物(如曲妥珠单抗)可以改善疾病的发展提高预后,但是仍然存在高度的复发和药物治疗抵抗风险,尤其是在肿瘤转移部位。目前,临床主要通过对乳腺癌患者原发肿瘤病灶进行免疫组织化学(IHC)以及基于基因萤光原位杂交(FISH)的方法评估患者是否适合采用抗HER2药物疗法。但是,乳腺癌是一种异质性疾病,基因的不稳定是其重要特征之一,虽然有许多研究证实乳腺癌患者原发肿瘤和其相对应的转移部位肿瘤HER2表达水平有高度的一致性,但是经过一系列治疗后,部分病人肿瘤原发部位和远处转移部位的抗原表型会发生改变,因此仅根据原发肿瘤表型制定个体化治疗方案是不准确的。现如今使用一种非侵入式的血液检测方法,即通过检测原位肿瘤或其转移灶释放到血液中的循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA以及肿瘤细胞来源的外泌体,来提示肿瘤的发展进程及耐药性等信息,为指导个体化治疗以及疾病的实时监测提供了可靠的依据。液态活检与现有传统活检方法相比,前者无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出显著的优势,应用发展潜力巨大,主要检测对象包括:循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)、循环肿瘤 DNA(circulating tumorDNA,ctDNA)以及肿瘤外泌体(exosome)等,它们来源于肿瘤组织,可以实时监测肿瘤细胞生长进程及其耐药性,以便制定精准的个体化治疗方案。其中CTCs检测是“液态活检”的重要工具,是目前转化医学研究的热点。大量的临床研究结果提示,CTCs具有重要的临床应用潜能。循环肿瘤细胞(CTCs)是指从肿瘤原发部位或是远处转移部位上脱落并进入循环系统的癌细胞,并可以通过简单的血液检测来发现。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比,CTCs检测具有明显优势:(1)CTCs比传统方法更敏感地发现肿瘤的变化,并对肿瘤患者的预后、复发和转移进行监控;(2)只需要抽取病人少量外周血即可进行CTCs检测,是一种非侵入性的监测过程;(3)在疾病发展的不同阶段、不同时间均能进行多次检测。在许多恶性肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、大肠癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌等中均能发现CTCs,但血液中存在可检测CTCs的患者比例随癌症类型的不同而不同。循环肿瘤细胞在早期或转移性乳腺癌病人外周血中可以作为一种很容易检测的生物标志物可实时监控肿瘤的进展情况,用于乳腺癌早期转移的预测标志以及指导治疗。但是血液中存在大量的白细胞及红细胞,每1Oml血液中,CTCs的数目可能仅有几个到几十个,1Oml血液中含有的白细胞就高达1亿个,红细胞约有500亿个。所以必须采用非常灵敏的检测手段才能准确检测到癌症病人血循环中稀少的循环肿瘤细胞。外泌体是一种内体来源的微囊泡,体积小并具有特定的物理结构。肿瘤细胞来源的外泌体包含特定的抗原,具有潜在的免疫检测价值。因此,本课题使用一种来自海洋生物海肾的生物萤光蛋白序列,与HER2抗体的单链可变片段(single-chain variable fragment,scFv)结合,这种嵌合anti-HER2-Renilla萤光素酶融合蛋白可以靶向HER2阳性细胞表面抗原并且与相应的底物作用后释放萤光。利用这一原理,可对乳腺癌病人外周血中HER2阳性循环肿瘤细胞及表达HER2阳性抗原的外泌体进行检测。研究目的这项研究的目的是建立一个新的HER2阳性循环肿瘤细胞检测方法(抗-HER2-海肾萤光素融合蛋白检测方法),它可以为临床医生提供一个有价值的参考,帮助临床医生进行诊断和指导个体化治疗决策。研究方法1.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白质粒构建、转染及生物活性检测;2.细胞实验:(1)SK-BR-3 HER2阳性细胞和MDA-MB-231HER2阴性细胞的培养;(2)抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白与乳腺癌细胞系的选择性结合实验:LB942多功能微孔板分析仪检测抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白与HER2阳性细胞(SK-BR-3)和HER2阴性细胞(MDA-MB-231)的结合能力;(3)抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白特异性检测:用不同稀释浓度的HER2抗体与SK-BR-3细胞孵育,不同程度封闭HER2抗原结合位点,而后再将细胞与抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白孵育,检测光度值;(4)抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白敏感性检测:将不同细胞数的SK-BR-3细胞和固定细胞数的MDA-MB-231(105)混合后再与抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白一起孵育,检测抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白从大量背景细胞中检测出HER2阳性细胞的能力。3.小鼠体内实验:(1)建立小鼠皮下乳腺癌肿瘤模型,尾静脉注射抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白,分别在不同时间(2、4、6以及8小时)尾静脉注入底物,用小鼠成像仪检测生物光信号;(2)实验末期,小鼠心脏采血,检测小鼠血液中HER2阳性CTCs。4.乳腺癌病人血标本HER2阳性CTCs检测:收集乳腺癌及乳腺纤维腺瘤病人血标本,Ficoll密度梯度法分离出乳腺癌患者血液中外周血单个核细胞,与抗-HER2-海肾光素酶融合蛋白一起孵育后,LB942多功能微孔板分析仪检测生物光信号。5.循环肿瘤细胞筛选实验:(1)将不同细胞数SK-BR-3细胞和固定数量的MDA-MB-231(105)混合,再加入抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白,用包被有蛋白A/G的板子筛选出结合了抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白的HER2阳性SK-BR-3细胞,检测光度值;(2)将收集的乳腺癌病人血标本同样用蛋白A/G包被的板子筛选后,检测光度值;(3)细胞免疫荧光染色(IF)检测筛选出的细胞HER2的表达。6.细胞系来源的HER2阳性外泌体检测:用抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白法识别并结合HER2阳性细胞来源的细胞培养基中的外泌体,然后用试剂盒沉淀法提取外泌体,检测光度值。7.统计学分析:所有实验结果均采用单因素方差分析法或Student’s t检验。所有实验重复3次,P<0.05被认为差异有统计学意义研究结果1.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白能够特异性的从大量背景细胞中有效识别HER2阳性细胞。2.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白无法识别小鼠乳腺癌肿瘤模型中的HER2阳性细胞,但是可检测到小鼠血样本中的HER2阳性细胞。3.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白可有效识别乳腺癌病人外周血中HER2阳性循环肿瘤细胞。4.蛋白A/G包被板子可有效筛选出结合了抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白的HER2阳性细胞。5.抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白同样可以识别HER2阳性乳腺癌细胞系来源的外泌体。结论抗-HER2-海肾萤光素酶融合蛋白可有效检测HER2阳性循环肿瘤细胞及HER2阳性外泌体。