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目的:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关慢加急性肝功能衰竭(acute on chronic liver failure,ACLF)是在慢性乙型肝病基础上出现的严重的肝细胞坏死、凋亡,继而引起严重的肝功能损害和各种并发症的临床综合征。其病情凶险,进展迅速,预后不良。目前大多数学者认为其发病机制与免疫损伤密切相关。有研究称:在肝衰竭患者的外周血中存在“免疫紊乱”状态,但目前尚无确切的指标能够明确患者的免疫状态。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3,NLRP3)炎性体是一种多蛋白复合体,属于固有免疫系统,通过识别外源性及内源性损伤因子发挥作用。研究发现其在急性肝衰竭发挥促炎作用,但其在HBV相关ACLF中的作用尚未阐明。本研究通过检测HBV相关ACLF患者外周血、肝组织中NLRP3、Caspase-1及细胞因子白细胞介素-1β(interleukin,IL-1β)、IL-18的表达,初步探讨NLRP3炎性体在HBV相关ACLF患者中的作用。方法:选取2016年1月至2016年10月河北医科大学第三医院门诊或住院患者,HBV相关ACLF患者30例(ACLF组)、CHB患者30例(CHB组)和健康体检者15例(健康对照组)。此外,收集接受肝移植的HBV相关ACLF患者肝组织8例、肝组织活检的CHB患者肝组织8例和正常供体肝组织5例。检测入组患者血清ALB、ALT、AST、TB、DB、INR、HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平。流式细胞学检测外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3的表达量及表达位置。实时荧光定量(quantitative real-time)PCR检测PBMC、肝组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA的表达,并对PBMC进行磁珠分选,应用RT-qPCR分别检测CD14+单核细胞、CD14-PBMC细胞群中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达;免疫组织化学染色法检测肝组织中NLRP3的表达以及与CD68共同表达。结果:1一般资料:各组研究对象年龄、性别比例具有可比性。ACLF组患者血清alt、ast、tb、db、inr水平明显高于chb组及健康对照组(p<0.01);aclf组患者alb、hbvdna水平明显低于chb组(p<0.01)。2乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组外周血单个核细胞中nlrp3的表达下降应用流式细胞学技术分析各组患者外周血单核细胞中nlrp3的表达水平(mfi),结果显示:aclf组nlrp3的表达量明显低于chb组和健康对照组(p<0.01)。chb组nlrp3的表达亦低于健康对照组(p<0.01)。进一步分析aclf中晚期和aclf早期患者单核细胞中nlrp3的表达,结果显示:aclf中晚期患者明显低于aclf早期患者(p<0.01)。应用rt-qpcr检测pbmc中nlrp3的表达,结果显示:aclf组nlrp3mrna水平低于chb组和健康对照组(p<0.05)。chb组nlrp3mrna的表达亦低于健康对照组(p<0.01)。3nlrp3主要表达在cd14+cd16+单核细胞群nlrp3在单核细胞亚群中的表达:在cd14++cd16-单核细胞群和cd16++cd14-单核细胞群,aclf组、chb组、健康对照组中nlrp3的表达未见明显差异(p>0.05);在cd14+cd16+单核细胞群,aclf组、chb组均低于健康对照组(p<0.01),aclf组nlrp3的降低最为明显,尤其是aclf中晚期患者。同时,应用cd14磁柱分离pbmc,分别检测cd14+单核细胞、cd14-pbmc中nlrp3mrna水平。aclf组、chb组cd14+单核细胞中nlrp3mrna水平明显低于健康对照组(p<0.05),以aclf组降低显著。而三组在cd14-pbmc细胞中nlrp3mrna的表达未见明显差异(p>0.05)。4乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组肝组织中nlrp3的表达升高免疫组织化学染色结果显示:aclf组肝组织中nlrp3的表达明显高于chb组(p<0.01),健康对照组肝组织未见nlrp3表达。nlrp3在汇管区与小叶内均有表达,以小叶内为主,cd68与nlrp3共染提示:nlrp3主要表达于肝小叶内kupffer细胞胞浆。rt-qpcr检测肝组织中nlrp3mrna的表达显示:aclf组nlrp3mrna的表达高于chb组和健康对照组(p<0.01)。chb组nlrp3mRNA的表达亦高于健康对照组(P<0.01)。5乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组外周血单个核细胞中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达下降RT-qPCR检测PBMC中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达显示:ACLF组Caspase-1、IL-1βmRNA水平均低于CHB组Caspase-1、IL-1β水平,IL-18 mRNA于两组未见明显差异(P>0.05),ACLF组与健康对照组mRNA水平未见明显差异(P>0.05)。PT-q PCR检测CD14磁珠分选后Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达显示:ACLF组CD14+单核细胞Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达低于CHB组Caspase-1、IL-1β、IL-18 m RNA水平,ACLF组CD14-PBMC中Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达低于CHB组Caspase-1、IL-1β、IL-18 mRNA的表达。ACLF组与健康对照组未见明显差异(P>0.05)。6乙型肝炎病毒相关慢加急性肝功能衰竭组肝组织中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18的表达升高RT-qPCR检测肝组织中Caspase-1及细胞因子IL-1β、IL-18mRNA的表达显示:ACLF组IL-1βmRNA、IL-18mRNA的表达均高于CHB组及健康对照组(P<0.05或P<0.01)。ACLF组Caspase-1mRNA的表达与CHB组差异无统计学意义(P>0.05)。7 ACLF组患者CD14+CD16+单核细胞NLRP3的表达量与患者MELD评分呈负相关(R=-0.74),相关具有统计学意义(P<0.01)。结论:1 NLRP3炎性体在HBV相关慢加急性肝功能衰竭患者外周血表达降低,可能与免疫抑制有关。2 NLRP3主要表达于CD14+CD16+单核细胞,通过向肝脏募集,造成肝脏损伤。