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猪繁殖与呼吸综合征俗称“蓝耳病”,是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的高度接触性传染病,严重威胁全球养猪业发展。PRRSV具有抗体依赖性增强(Antibodydependent enhancement,ADE)效应,是造成持续性感染、免疫失败及疫苗效果不佳的重要原因。FcγR是PRRSV靶细胞——猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAM)上高表达的膜受体,通过结合病毒-抗体免疫复合物(Immune complex,IC),介导病毒ADE效应,并参与免疫细胞内信号的调节及机体炎症反应。FcγR存在多种亚型,研究发现人和小鼠FcγR基因存在选择性剪接,关于猪FcγRI的可变剪接及其参与PRRSV ADE的机理尚不清楚。为了进一步明确FcγRI在PRRSV ADE效应中的作用,本文通过体外细胞感染模型,研究了FcγRI的可变剪接特征,膜型及可溶型FcγRI在介导细胞内吞、抗原递呈、致炎性作用中的功能,以及ADE特异性细胞应答。这为理解FcγRI在PRRSV ADE效应中调控作用的分子机制和免疫应答特征,认识PRRSV独特的致病及免疫机制提供了证据。主要结果如下:(1)猪FcγRI存在多种转录剪接体:从3头猪PAM细胞中克隆到多种FcγRI转录剪接体,与猪基因组的GenomeScan分析表明,猪FcγRI基因通过3’端可变剪接产生至少6种剪接体,包括2种膜型和4种缺失跨膜区、潜在分泌型的可溶型FcγRI。对3头猪个体的原代PAM细胞及传代细胞3D4/21中FcγRI的125个克隆分析表明,不同FcγRI转录剪接体普遍表达于多种体内原代细胞及3D4/21体外培养细胞系。单基因测序分析表明,PAM细胞上的FcγRI主要以膜型为主,约占转录本的74%~91%,为优势转录本。(2)猪膜型FcγRI参与PRRSV-IC的内化,介导PRRSV ADE作用:将构建的膜型、可溶型FcγRI真核表达载体,分别转染PRRSV敏感细胞3D4/21及非敏感细胞293T,通过FcγRI抗体阻断实验、病毒载量测定、confocal观察网格蛋白变化等,比较了PRRSV ADE效应下的细胞应答,研究了膜型、可溶型FcγRI在PRRSV ADE中的作用。利用相对荧光定量PCR、confocal方法发现,过表达膜型FcγRI(pcDNA3.1-T1)可增强PRRSV-IC对3D4/21和293T细胞的感染,而可溶型FcγRI(pcDNA3.1-T3)不具备介导PRRSV ADE的能力。Confocal结果表明,膜型FcγRI通过增强网格蛋白的表达及募集,促进成熟溶酶体的形成及转运,介导病毒内化。Real-time PCR结果表明,高丰度的可溶型FcγRI转录表达,可上调PRRSV ADE感染中IFN-β、TNF-α、IL-1β炎性因子及抗原递呈分子MHC-I、II表达,促进细胞的炎性反应,负向调控PRRSV ADE效应。而膜型FcγRI的高表达,抑制了TLR7,下调了干扰素的产生。(3)PRRSV上调细胞中可溶型FcγRI比率,ADE作用抑制机体抗病毒反应,影响靶细胞应答,增强FcγR介导的内吞,抑制炎性因子转录,诱导特异性TCRVβ细胞亚群增殖。研究了有、无PRRSV特异性抗体下PRRSV感染3D4/21细胞,几种FcγR的转录变化,Real-time PCR显示PRRSV仅上调了FcγRI的转录,而PRRSV通过特异性抗体介导的ADE感染时,FcγRIIB转录提高4倍且FcγRI被抑制。利用单基因-高分辨率熔解曲线(SGA-HRM)发现,受PRRSV影响显著上调的FcγRI主要为可溶型FcγRI,比例由19.5%(感染前)升至33.3%(感染后)。转录组分析数据也表明,ADE显著提高了FcγR介导的内吞,增强FcγRIIB的转录,影响细胞表面FcγR的平衡,抑制抗病毒免疫应答。经转录组分析及RT-PCR验证,ADE作用抑制TLR7、RIG-I/MDA5,降低IL-1β、TNF-α、IFN-β炎性因子和MHC分子表达,上调Th2细胞标志性因子(IL-4)的转录。通过克隆90条TCRVβ序列,构建猪TCRVβ基因文库,利用单基因测序方法确定了PRRSV ADE特异性增殖活化的TCRVβ细胞亚群为pTVB11。综上,本研究明确了猪FcγRI的6种剪接转录模式,包括2种膜型和4种可溶型FcγRI;表明膜型FcγRI能通过ADE效应介导PRRSV的内吞,促进病毒增殖;研究了PRRSV引起的细胞应答特点,表现为可溶型FcγRI剪接概率升高,Th2类细胞因子上调,ADE效应下炎症因子分泌减弱,抗原递呈分子下调;明确了PRRSV活化的特异性T细胞亚群pTVB11。