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目的:随着全球糖尿病的患病率日益增加,糖尿病的并发症越来越受到人们的重视,而眼部做为糖尿病最易受累的器官之一,可引起眼部诸多病变,其中白内障是糖尿病患者视力下降的主要原因之一。但糖尿病性白内障发病机制尚未被全部阐明,深入研究了解其发病机制,从而延缓、阻止其发生发展,有着重要的临床意义。人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）的过度凋亡目前被认为是白内障的主要致病机制之一。细胞凋亡是被广泛认可的细胞程序性死亡形式之一,但近年来,我们对细胞程序性死亡的各种形式有了更加多元化的理解,其中包括凋亡、焦亡、程序性坏死、自噬等。焦亡也称为caspase-1依赖的程序化细胞死亡,由激活的炎症小体介导,最终依赖焦孔素D（gasdermin D,GSDMD）发挥效应,并伴随着促炎因子的释放。焦亡可以由许多病理刺激引发,在包括缺血性脑损伤、心脏疾病、多种肿瘤性疾病等方面发挥着重要作用。细胞焦亡也在包括白内障在内的多种眼科疾病中逐渐受到重视。已有研究表明细胞焦亡标志物NLRP3、active Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β等在白内障患者中表达明显升高,提示焦亡可能同凋亡一样,在白内障发病过程中有着非常重要的作用。在白内障的发病机制中,氧化应激损伤为重要因素之一,ROS（reactive oxygen species）诱导的晶状体上皮细胞损伤可能导致包括蛋白质及脂质氧化、DNA损伤等,最终导致白内障的发生,而DJ-1蛋白是一种重要的抗氧化蛋白,其由人类1号染色体上的PARK7基因编码,广泛分布于各组织细胞,是一种氧化应激反应蛋白,与细胞氧化应激的调节密切相关。已有研究表明,DJ-1的过表达可以有效的产生抗氧化应激反应,并抑制细胞的凋亡及焦亡,从而达到减少细胞在氧化应激反应中的细胞损伤。目前DJ-1基因对糖尿病性白内障的作用尚不明确,本实验拟通过研究糖尿病性白内障的发病过程中焦亡及凋亡发生情况,以及DJ-1基因对焦亡及凋亡抑制作用及机制,进一步揭示糖尿病性白内障致病机制,以及探索DJ-1能否过表达延缓糖尿病性白内障的进展,为糖尿病性白内障的治疗提供新的思路。方法:1、通过腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）构建糖尿病SD大鼠模型,并腹腔注射溶剂设立对照组。2、用大体解剖和HE染色观察实验组及对照组SD大鼠8周、12周时晶状体差异。3、Real-time PCR和Western blot检测实验组及对照组SD大鼠晶状体上皮细胞中DJ-1表达情况。4、Western blot检测实验组和对照组SD大鼠晶状体上皮细胞中焦亡标志物NLRP3、cleaved-Caspase1和IL-1β的表达情况。5、培养人晶状体上皮细胞并慢病毒感染:人晶状体上皮细胞HLE-B3细胞进行复苏、传代、细胞计数等技术后,按实验计划分组,分为未感染组、空载体组、DJ-1过表达组、NC组、DJ-1沉默组分别进行感染慢病毒,并应用Real-time PCR及Western blot验证DJ-1过表达/沉默效率。6、实验分组、细胞处理:按分组进行感染,感染48 h后,实验分组分为A:空白对照组、B:高渗对照组、C:高糖组、D:高糖+空载体组、E:高糖+DJ-1过表达组、F:高糖+NC组、G:高糖+DJ-1沉默组。高糖组使用含55.5 m M葡萄糖的培养基处理48小时,高渗组使用含5.5 m M葡萄糖+50 m M甘露醇的培养基处理48小时。7、利用Real-time PCR和Western blot检测各组细胞焦亡及凋亡相关标志物mRNA及蛋白表达情况。8、检测各组细胞增殖能力:本部分应用CCK-8实验检测各组细胞增殖能力情况。9、利用ROS、MDA、SOD、LDH试剂盒及免疫荧光技术评估各组细胞氧化损伤及抗氧化能力。10、利用Annexin V-FITC/PI双染标记细胞、JC-1线粒体膜电位检测法、吖啶橙（Acridine Orange,AO）/溴乙锭（Ethidium Bromide,EB）染色及扫描电镜检测各组细胞的凋亡及焦亡情况。11、所有数据均以均值±标准差表示,为三次独立重复实验的结果。应用Graphpad Prism9.0统计分析软件进行统计学分析。采用独立样本t检验（independent samples t-test）及单因素方差分析（one-way ANOVA）对各组数据进行分析。P＜0.05为有统计学意义。结果:1、糖尿病SD大鼠模型构建:结果示8周、12周时实验组血糖分别为20.7±2.27mmol/l,23.35±2.9mmol/l,明显高于对照组,差异具有统计学意义（*P＜0.05）。2、对实验组和对照组SD大鼠进行大体对比观察:注射STZ后SD大鼠晶状体由8周时高度混浊,晶状体周围出现空泡到12周后晶状体呈完全混浊,而对照组SD大鼠晶状体呈现完全透明。HE染色结果8周、12周时对照组:晶状体被均匀染成红色,上皮细胞排列整齐,形态规则,排列有序,均匀分布;而实验组:晶状状体上皮细胞出现多层次现象,细胞排列紊乱,大小不一,少量炎性细胞浸润;12周时晶状体上皮细胞脱落,细胞排列紊乱,大量炎性细胞浸润。3、检测DJ-1在实验组和对照组SD大鼠晶状体表达情况:Real-time PCR和Western blot检测实验组大鼠晶状体上皮细胞中DJ-1表达较对照组下降,差异具有统计学意义（**P＜0.001）。4、检测实验组和对照组SD大鼠晶状体上皮细胞中焦亡的情况:Western blot检测实验组8周、12周SD大鼠晶状体组织中NLRP3、cleaved-Caspase1和IL-1β的表达水平较对照组增加,差异具有统计学意义（**P＜0.001）,表明焦亡在糖尿病性白内障发病过程中有着重要作用。5、慢病毒感染并划分实验组:应用Real-time PCR及Western blot验证DJ-1过表达/沉默效率,结果显示慢病毒感染成功,各组DJ-1表达差异明显,具有统计学意义（**P＜0.001）。6、Real-time PCR和Western blot检测各组细胞凋亡相关基因及蛋白表达差异:高糖组与对照组相比,其LECs中Bax、Caspase3（cleaved-Caspase3）、p53（p53 acetyl K379）的表达增加,Bcl-2、SIRT1表达下降,差异具有统计学意义（**P＜0.001）。而DJ-1过表达组与空载体组相比,其DJ-1高表达,并且Bax、Caspase3（cleaved-Caspase3）、p53（p53 acetyl K379）表达水平减低,而Bcl-2、SIRT1表达增加,差异具有统计学意义（**P＜0.001）,DJ-1沉默组与NC组相比,DJ-1沉默后,Bax、Caspase3（cleaved-Caspase3）、p53（p53 acetyl K379）表达进一步增加,而Bcl-2、SIRT1表达明显下降,差异具有统计学意义（**P＜0.001）。结果表明高糖LECs处理后,其凋亡相关基因及蛋白表达增加,而抗凋亡基因及蛋白表达下降,提示高糖处理后LECs凋亡增加,而DJ-1高表达后,LECs凋亡相关基因及蛋白表达明显下降,而抗凋亡基因及蛋白表达增加,同时SIRT1表达增加,降低了p53的乙酰化水平,进一步抑制了p53的激活,从而抑制了LECs的凋亡。7、Real-time PCR和Western blot检测各组细胞焦亡相关基因表达差异:高糖组与对照组相比,经高糖处理的LECs的NLRP3、IL-1β（mature IL-1β）、Caspase1（cleaved-Caspase1）表达增加,Nrf2、HO-1、NQO1表达下降,差异具有统计学意义（**P＜0.001）。而DJ-1过表达组与空载体组相比,其NLRP3、IL-1β（mature IL-1β）、Caspase1（cleaved-Caspase1）表达水平减低,而Nrf2、HO-1、NQO1表达增加,差异具有统计学意义（**P＜0.001）。DJ-1沉默组与NC组相比,DJ-1沉默后,NLRP3、IL-1β（mature IL-1β）、Caspase1（cleaved-Caspase1）表达进一步增加,而Nrf2、HO-1、NQO1表达明显下降,差异具有统计学意义（**P＜0.001）,结果表明高糖环境下LECs焦亡标志基因及蛋白表达增加,同时Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1等抗氧化基因及蛋白表达降低,提示高糖可诱导LECs的焦亡增加,同时降低Nrf2介导的抗氧化能力,增加DJ-1表达,LECs焦亡明显下降,并提高了Nrf2介导的抗氧化能力。8、利用CCK-8实验检测各组细胞增殖能力:与对照组相比,高糖处理后,晶状体上皮细胞活力显著降低（分别为88.5%和64.9%,**P＜0.001）,DJ-1过表达组较空载体组细胞活力显著升高（分别为79.5%和64.3%,**P＜0.001）,而DJ-1沉默组与NC组相比,细胞活力进一步降低（分别为79.5%和64.3%,**P＜0.001）,差异均具有统计学意义。9、流式细胞术检测各组细胞凋亡的情况:利用Annexin V-FITC/PI双染标记细胞及JC-1线粒体膜电位检测法并使用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡比例,结果显示高糖处理组,晶状体上皮细胞凋亡较对照组明显升高,差异具有统计学意义。而DJ-1过表达后细胞凋亡显著下降,差异具有统计学意义（**P＜0.001）。10、免疫荧光:免疫荧光检测结果显示高糖处理组中Nrf2的入核较对照组减少,当DJ-1沉默后Nrf2较NC组相比入核进一步下降,但当DJ-1过表达处理后中Nrf2的入核水平明显升高。11、评估各组细胞氧化损伤情况:高糖诱导的模型组较对照组中ROS、MDA、LDH升高,而SOD活性明显下降,而DJ-1过表达处理后较空载体组ROS、MDA、LDH明显下降,同时SOD活性明显增高,差异均具有统计学意义（**P＜0.001）。12、利用AO/EB染色评估各组细胞焦亡情况:高糖组:少量正常细胞着绿色荧光,大量呈橘红色荧光,并有个别细胞核出现固缩现象,即破膜细胞数增加,说明晶状体上皮细胞焦亡及凋亡细胞比例增加;而DJ-1过表达处理后上述情况得到明显改善,DJ-1沉默处理后,得到了相反的结果。13、扫描电镜观察细胞焦亡形态:高糖组:细胞肿胀膨大且出现大量孔隙,此时发生细胞焦亡,DJ-1过表达处理后,细胞孔隙减少,发生细胞焦亡情况减少,而DJ-1沉默后可见晶状体上皮细胞焦亡明显增加。结论:在糖尿病性白内障发病过程中,焦亡和凋亡同样发挥着重要作用,DJ-1过表达后可改善细胞活力,同时DJ-1可能通过SIRT1-p53途径抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞凋亡。同时可能涉及调节Nrf2信号抑制氧化应激进而抑制NLRP3介导的焦亡,从而延缓糖尿病性白内障的发生发展。