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创伤性颅脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是平战时致死致残率最高的创伤之一;严重颅脑损伤如弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury,DAI)后,机体交感兴奋异常增高,常表现为阵发性交感功能亢进(paroxysmal sympathetic hyperactivity,PSH),如心率快,体温、血压高,呼吸急促,大汗淋漓,肌张力增高,多伴血浆去甲肾上腺素等儿茶酚胺水平升高。后者常导致患者颅内病情加重,颅外并发症增多,增加救治难度,延长住院时间,恶化预后甚至致使患者死亡。目前TBI后交感兴奋的病理机制仍不明确,相关研究表明,下丘脑室旁核(Paraventricular nucleus,PVN)自主神经功能和神经内分泌的重要调节中枢,在多种病理情况下中枢神经系统(Central nervous system,CNS)小胶质细胞活化并分泌炎性因子改变PVN区分子环境是调控交感兴奋的关键。近年来,中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)在CNS中的病理生理作用及规律越来越受人们重视,结合课题组前期研究表明,TBI后实验动物3天后PVN区ROS水平明显升高与临床上TBI后交感兴奋的延迟发作相符,而ROS水平升高是诱导NETs形成的经典途径。因此本研究提出以下假设:TBI后中性粒细胞趋化至PVN并激活,致细胞内ROS水平持续升高,从而诱导中性粒细胞释放NETs或NETs成分如LL37变化,NETs通过LL37/P2X7/MST1通路促进小胶质细胞活化和IL-1β释放,进而调控神经递质水平及功能、增强前交感神经元的活性,导致交感兴奋。本研究拟在前期课题组的研究基础上通过以下实验验证假设1、验证DAI后大鼠交感神经活性变化规律,同时观察PVN区NETs形成及水平,验证其相关性并确定最佳观察时间点;2、验证大鼠DAI后交感兴奋观察点循环血及PVN区NETs形成情况;3、再通过细胞实验验证NETs通过Hippo/MST1通路促进小胶质细胞活化继而调控交感神经兴奋。第一部分:PVN区中性粒细胞胞外陷阱(NETs)形成水平与大鼠DAI后交感神经兴奋的相关关系目的:1、验证大鼠DAI后交感神经兴奋规律,为后续研究确定最佳观察点;2、测定大鼠DAI后PVN区NETs形成情况。方法:1、选取SD大鼠雄性70只,随机分成DAI打击组(n=40),对照组(n=30)。经过弥漫性轴索损伤模型打击后,DAI组与对照组分别按9h、24h、48h、72h、96h分成5个亚组。应用ELISA法检测各组大鼠血浆间羟肾上腺素(MN)和间羟去甲肾上腺素(NMN)水平明确其动态变化规律,应用western-blot检测大鼠PVN区NETs形成标记物Cit H3表达情况。结果:1.大鼠在DAI后9h血浆MN水平略有升高,24h明显升高(P<0.05),72h达到峰值,96h随后缓慢平稳,但仍高于对照组(P<0.01)。DAI后9h血浆NMN水平开始升高(P<0.05),24h略有下降,随后48h再次升高,72h达到峰值,96h随后呈缓慢下降趋势,但仍高于对照组(P<0.01)。2、大鼠DAI后24h左右PVN区开始出现NETs标记物Cit H3,但程度较小,在72h左右程度进一步增加,此后呈进一步上升趋势。结论:1、大鼠DAI后产生交感神经兴奋。其血浆儿茶酚胺基线水平升高,在72h达到峰值,后逐渐平缓。2、大鼠DAI后24h左右PVN区存在NETs形成,并在72h进一步增加。3、大鼠DAI后72h是损伤后交感兴奋的最佳观察时间点。第二部分:大鼠DAI后交感兴奋观察时间点循环血及PVN区NETs形成情况目的:验证大鼠DAI后交感兴奋观察时间点(72h)循环血及PVN区NETs形成情况;方法:选取雄性SD大鼠16只,随机分成DAI打击组(n=10),对照组(n=6)。在DAI打击后第72h取标本,通过流式细胞术检测交感兴奋观察点大鼠循环血NETs形成情况并利用免疫荧光法检测观察PVN区NETs标记物,明确NETs形成。结果:1、以Cit H3+及MPO+双阳性作为NETs形成细胞的标志,通过流式细胞术对大鼠循环血NETs的形成比例进行分析,结果提示,DAI后72h大鼠循环血的NETs平均生成率为40%,而对照组循环血NETs的平均生成率为16.7%。差异存在统计学意义(P<0.05)。2、通过对大鼠PVN区NETs的特异性表达蛋白Cit H3进行免疫荧光染色,荧光结果显示,对照组PVN组织内几乎无Cit H3荧光表达,而DAI后72h,PVN组织内Cit H3荧光表达显著增多。结论:1、DAI后72h大鼠循环血NETs形成显著高于对照组。2、DAI后72h大鼠PVN区存在NETs形成,对照组大鼠PVN区几乎无NETs形成。3、大鼠DAI后72h是研究大鼠循环血及PVN区NETs形成时间点。第三部分:大鼠DAI后NETs通过Hippo/MST1通路激活小胶质细胞诱导中枢炎症反应目的:明确NETs形成通过产生LL37激活小胶质细胞膜受体P2X7激活Hippo/MST1通路,激活小胶质细胞并促进分泌炎性因子。方法:提取大鼠DAI后72h的循环血中性粒细胞并与大鼠神经小胶质细胞共培养,利用免疫共沉淀法检测目标细胞体系中LL37与P2X7的相互作用;再分别利用PAD4抑制剂YW3-56抑制NETs形成及Hippo/MST1通路抑制剂XMU-MP-1抑制MST1活化后通过q PCR及Western blot法检测细胞体系中MST1、YAP的m RNA及蛋白水平变化规律;最后利用ELISA法检测细胞体系中IL-1β的含量变化。结果:1、大鼠DAI后72h的循环血中性粒细胞与大鼠神经胶质细胞共培养体系中,P2X7和LL37之间存在相互作用。2、大鼠中性粒细胞与小胶质细胞共培养体系中,DAI大鼠的中性粒细胞能促进该体系内的MST1转录及表达,加入PAD4抑制剂YW3-56抑制NETs形成后,体系内的MST1转录及表达量下降。3、大鼠中性粒细胞与小胶质细胞共培养体系中,DAI大鼠的中性粒细胞能促进该体系内Hippo/MST1通路下游蛋白YAP的转录及表达,加入PAD4抑制剂YW3-56后,体系内的YAP转录表达量下降;加入Hippo/MST1通路抑制剂XMU-MP-1后,该细胞体系内的YAP转录表达下降。4、DAI大鼠中性粒细胞与小胶质细胞共培养体系中IL-1β含量高于正常对照组;加入PAD4抑制剂YW3-56抑制NETs形成后IL-1β含量下降;加入Hippo/MST1通路抑制剂XMU-MP-1抑制MST1活化后,该细胞体系内的IL-1β含量下降。结论:1、大鼠中性粒细胞与神经小胶质细胞共培养体系中,NETs中的LL37与小胶质细胞膜受体P2X7之间存在相互作用。2、PAD4抑制剂YW3-56抑制NETs形成能够抑制Hippo/MST1通路中MST1及其下游效应蛋白YAP表达,并进一步抑制小胶质细胞活化释放IL-1β。3、Hippo/MST1通路抑制剂XMU-MP-1抑制MST1活化能够抑制大鼠中性粒细胞与神经小胶质细胞共培养体系中Hippo/MST1通路效应蛋白YAP表达,并进一步抑制小胶质细胞活化释放IL-1β。4、在DAI大鼠中性粒细胞与大鼠小胶质细胞共培养体系中,NETs形成并释放LL37通过激活小胶质细胞膜受体P2X7并进一步激活Hippo/MST1通路促进大鼠神经小胶质细胞激活并释放炎性因子。