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DNA的碱基序列具有丰富的结构和功能信息,通过合理的序列设计可以用来精确地构建二维和三维的宏观产物。通过DNA交联而形成的DNA水凝胶具备了生物相容性,稳定性以及可调的生物多功能性等优点,在生物传感和生物医学方面引起了越来越多的研究兴趣。其中,刺激响应性DNA水凝胶也称为智能DNA水凝胶在不同的触发因素下,能够发生凝胶到溶胶之间的可逆、可切换的转变,从而作为用于生物传感的智能材料,引起了研究者们的极大兴趣。本研究旨在以典型的疲劳生物标志物肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme,CK-MB）作为检测目标物,针对目前检测方法存在的实验处理过程繁琐,受限于实验室环境等技术瓶颈问题,探索基于刺激响应性DNA水凝胶的检测方法,依据适配体对目标物的特异性识别和结合原理,设计并制备目标物响应性DNA水凝胶,通过优化检测条件,同时结合多种信号放大方法和输出信号,构建出两种刺激响应性DNA水凝胶生物传感系统,进而实现了肌酸激酶同工酶的可视化灵敏检测。本论文的主要研究内容和结论总结如下:第一章:基于DNA水凝胶的微流控智能读数在POCT检测中的应用研究。设计和制备了一种靶向响应型DNA交联水凝胶,用于疲劳生物标志物中CK-MB的便携式可视化定量检测。首先,采用氯金酸还原法制备粒径为13 nm的金纳米颗粒（Gold nanoparticles,Au NPs）,通过经典的修饰方法将牛血清白蛋白（Bovine serum albumin,BSA）修饰在Au NPs上以避免其聚集。通过对检测条件进行优化,得出最佳的修饰浓度。之后,合成了包覆Au NPs的DNA水凝胶,该DNA水凝胶利用适配体作为交联剂,适配体识别目标物后,其构象发生变化使得DNA水凝胶交联链解离,水凝胶崩解,Au NPs释放出来即可用肉眼进行检测。为了使该方法适用于现场检测,进一步引入了微流控芯片,利用DNA水凝胶识别目标物前后的体积变化作为微流控液体通道的控制阀门,目标物的加入使得DNA水凝胶崩解,阀门开放,待测液进而流入检测区。利用手机或摄像机拍照后,可以使用Image J软件分析图像的平均灰度值。随着目标物浓度的增加,水凝胶释放出的Au NPs浓度增加,使得检测区颜色加深,平均灰度值降低从而实现目标物的便携式定量检测。使用微流控芯片获得的定量范围在0.2-625 n M之间,检出限达到0.027 n M。微流控芯片的引入为CK-MB的现场检测提供了一种可替代的方法,有望在部队平战时训练中对官兵的疲劳损伤进行保障。但从实验结果可以发现微流控芯片可以满足便携式检测,但是由于需要体积相变进行检测,所需要的目标物浓度较高。因此,如何进一步提高DNA水凝胶的检测灵敏度是本研究接下来努力的方向。第二章:基于EXPAR的Cas14a蛋白切割DNA水凝胶检测技术研究。构建了一种基于指数扩增反应（Exponential amplification reaction,EXPAR）和CRISPR相关核酸酶Cas14a的新型DNA水凝胶适配体传感技术,实现了对疲劳标志物CK-MB的高灵敏检测。该方法结合了靶标预扩增和Cas14a酶激活的双重优势,目标物检测信号在经过适配体转换为核酸信号后,利用EXPAR扩增进行第一重信号放大,然后在Cas14a效应蛋白高效侧枝裂解活性的辅助下进一步放大检测信号。具体地,利用目标物CK-MB和互补链（c DNA）与CK-MB适配体的竞争性结合,将解离出的c DNA链作为引物进行EXPAR扩增,从而形成指数放大的靶标DNA。该靶标DNA可被Cas14a蛋白识别,从而激活该蛋白。另一方面,设计合成了包覆杂化纳米片Pt NPs/Cu-TCPP（Fe）的DNA水凝胶。通过将两个不互补的寡核苷酸链（S1/S2）分别与聚丙烯酰胺链结合,形成线性聚合物PS1和PS2。然后我们使用在PS1、PS2之间形成桥梁的连接链（linker）来交联前体链,linker链含有单链的、富含T的Cas14a侧枝切割位点。最后,激活后的Cas14a可对DNA水凝胶的linker链进行高效的多周转的非特异性侧枝切割,从而崩解水凝胶释放包封物,包封物Pt NPs/Cu-TCPP（Fe）具有优异的类过氧化物酶活性,可以作用于3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）底物进行比色反应,从而进行反应物的量化。该方法可以获得低至0.157 p M(13.52 pg m L-1)的检测限,成功实现了CK-MB的高灵敏检测。该方法检测性能良好,所需要的实验条件较为宽松,操作简单,可为将来在检测痕量非核酸靶标的生物传感器的研制中打下基础。本论文制备了两种简单、稳定、特异性强的刺激响应性DNA水凝胶,利用其三维多孔结构包覆大量信号指示剂,通过结合微流控芯片、链霉亲和素-生物素、等温扩增和CRISPR等技术手段,构建了可用于便携式检测和高灵敏检测的两种刺激响应性DNA水凝胶生物传感方法,以期为疲劳生物标志物的检测提供一种可替代的技术手段。