【摘 要】
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目的研究内质网应激（ER stress）与TGF-β1的crosstalk（交互作用）在豚鼠实验性近视巩膜基质重塑中的作用及其机制。方法通过眼罩法建立豚鼠形觉剥夺性近视（FDM）模型,透射电镜（TEM）观察豚鼠巩膜组织超微结构,Western blot检测巩膜中ER stress标记蛋白GRP78、CHOP以及TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白（COL1A1）表达。离体研究:原代培养豚鼠巩膜成纤维细胞并鉴
【基金项目】
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上海市浦江人才计划（编号16PJD038）；
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目的研究内质网应激（ER stress）与TGF-β1的crosstalk（交互作用）在豚鼠实验性近视巩膜基质重塑中的作用及其机制。方法通过眼罩法建立豚鼠形觉剥夺性近视（FDM）模型,透射电镜（TEM）观察豚鼠巩膜组织超微结构,Western blot检测巩膜中ER stress标记蛋白GRP78、CHOP以及TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白（COL1A1）表达。离体研究:原代培养豚鼠巩膜成纤维细胞并鉴定;衣霉素（TM）、4苯基丁酸（4PBA）分别诱导和抑制细胞ER stress,TGF-β1蛋白和TGF-β1中和抗体分别上调和下调TGF-β1;TEM观察细胞内质网形态,免疫荧光、RT-PCR和Western blot检测细胞GRP78、CHOP、TGF-β1和COL1A1的表达。构建钙网蛋白（CRT）的RNA干扰序列,以慢病毒为载体导入细胞内,RT-PCR和Western blot验证CRT表达情况;分别双向干预ER stress和TGF-β1,免疫荧光、RT-PCR和Western blot法检测细胞中GRP78、CHOP、TGF-β1和COL1A1的表达。在体研究:在FDM豚鼠结膜下注射TM、4PBA、TGF-β1蛋白和TGF-β1中和抗体,观察豚鼠屈光度与眼轴的变化,检测巩膜组织中GRP78、CHOP、TGF-β1和COL1A1的表达。结果1.豚鼠FDM组4周后近视屈光度和眼轴较对照眼显著增加。FDM组豚鼠巩膜胶原纤维与对照组相比横径明显变细、密度降低,巩膜成纤维细胞内质网高度扩张肿胀;FDM组巩膜GRP78表达显著升高,CHOP表达未见明显变化。2.原代培养豚鼠巩膜成纤维细胞形态呈长梭形,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性;干预后,TM组与TGF-β1中和组内质网高度扩张、肿胀,伴有脱颗粒现象;TM组细胞GRP78、CHOP、TGF-β1蛋白和m RNA显著升高,COL1A1 m RNA表达显著升高;TM+4PBA组细胞中各因子表达均无显著变化;TGF-β1组与TGF-β1中和组均引起GRP78蛋白表达显著升高。以慢病毒为载体导入CRT的RNA干扰基因后72小时与96小时,CRT表达均明显下降;双向干预后,CRT（-）TM（+）组细胞TGF-β1与COL1A1均无明显变化;CRT（-）TGF-β1中和（+）组GRP78表达无明显变化。3.进一步在FDM模型中验证:下调TGF-β1能够引发豚鼠巩膜ER stress;ER stress早期的非折叠蛋白反应（UPR）能够促进TGF-β1与COL1A1的表达,并能抑制近视进展和眼轴延长。结论FDM豚鼠巩膜组织中存在ER stress;TGF-β1表达下调是巩膜ER stress的诱发因素;ER stress引发的非折叠蛋白反应能够促进TGF-β1表达增加;CRT是ER stress与TGF-β1在巩膜成纤维细胞中交互作用的的关键分子;ER stress早期的UPR能够促进TGF-β1与COL1A1的表达,并能抑制近视进展和眼轴延长。
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