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黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是—种主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物,广泛存在于花生、玉米、小麦等农作物中,通过食品和饲料途径使人畜中毒。AFB1具有强致癌、致畸、致毒性等作用,同时还可降低细胞免疫力。鉴于AFB1的巨大危害,国内外研究人员已经建立了多种检测方法。其中,基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析方法,具有简便快速、特异性好、适合高通量检测等特点,从而被广泛应用。高质量抗体的制备是建立特异性强、灵敏度高的免疫分析方法的关键。纳米抗体（Nanobody,Nb）是目前已知的最小抗原结合片段,具有易表达、水溶性好、稳定性高等性质,已广泛应用于食品安全分析、医学诊断等领域。同时,为提高酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的灵敏度,最直接的办法可通过基因改造,制备高亲和力的抗体来实现。本研究制备了抗AFB1纳米抗体,并对其进行定向改造,主要研究内容如下:1.抗AFB1纳米抗体的淘选、表达及活性分析以人工抗原AFB1-OVA为靶分子,进行四轮固相亲和淘选（1轮酸洗脱+3轮竞争洗脱）,从噬菌体展示的纳米抗体免疫文库中淘选得到16种独特的抗AFB1纳米抗体序列,其中克隆p HEN1-G8的阻断效果最佳,其半数抑制浓度（Inhibitory Concentration,IC50）值为0.98 ng/m L。将p HEN1-G8的基因克隆至载体p ET25b（+）构建重组载体p ET25b（+）-G8,转入E.coli Rosetta（DE3）表达菌株,经IPTG诱导表达并镍柱纯化,获得分子量约为20 KDa的纳米抗体Nb-G8。间接竞争ELISA测得其IC50为4.61 ng/m L,线性范围1.14 ng/m L18.59 ng/m L。2.p ET25b（+）-G8-AP融合蛋白的原核表达、纯化及活性分析将编码碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AP）的基因克隆至表达载体p ET25b（+）-G8中,构建融合表达载体p ET25b（+）-G8-AP,并在E.coli BL21（Rosetta,DE3）中进行原核表达。经ELISA分析,纯化后的融合蛋白G8-AP同时具有良好的抗原结合能力和碱性磷酸酶活性。G8-AP的碱性磷酸酶比活力为364.51±8.34 U/mg。融合蛋白G8-AP的IC50为5.25 ng/m L,线性范围1.0226.98ng/mL。与其它常见真菌毒素未见明显交叉反应,批内变异系数低于10%。3.纳米抗体Nb-G8的分子模拟及丙氨酸扫描同源建模构建Nb-G8的3-D结构模型,采用分子对接技术构建Nb-G8与AFB1的结合模型,预测了多个抗原抗体关键氨基酸结合热点。采用丙氨酸扫描技术初步对预测的6个关键氨基酸加以验证。6个关键氨基酸突变为丙氨酸后,T32A的生物活性与G8（Wild type,WT）相比,未见明显差异;而突变子I33A、F49A、W54A和V112A的灵敏度下降,突变子Y106A完全丧失抗原结合能力。4.纳米抗体Nb-G8定点饱和突变库的构建及淘选构建了三个定点饱和突变文库,完成Nb-G8的10个预测位点的饱和突变。分别对三个突变文库进行四轮固相亲和淘选,间接竞争phage-ELISA进行鉴定。突变子M1-4-12没有抗原结合活性;突变子M3-3-8、M3-3-12和M3-4-18不能被AFB1阻断;突变子M3-4-10和M3-4-13的灵敏度较野生型提高了15%。