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研究目的:靶向治疗是目前肿瘤治疗最具有发展前景的治疗手段之一。然而,在靶向治疗领域仍然存在许多尚未解决的问题,其中肿瘤靶向性与穿透性是进一步提高肿瘤治疗效果的关键。胃癌组织高表达EGFR分子,本论文选取靶向EGFR的单域抗体以及肿瘤穿透肽iRGD,构建融合蛋白,从以下两个方面进行了研究:(1)采用简捷、易行的方法,构建融合蛋白anti-EGFR-iRGD,在2D细胞、3D肿瘤多细胞球状体(MCS)及荷瘤裸鼠水平评价其靶向性、高穿透性及其体内外抗肿瘤作用;(2)对融合蛋白anti-EGFR-iRGD的应用进行了拓展,在MCS水平研究了融合蛋白anti-EGFR-iRGD对DOX、纳米粒子渗透性影响,及对抗肿瘤药物(5-FU、CPT-11、DOX、PTX、贝伐单抗、力扑素)抗肿瘤效果的影响。研究方法:利用DNA重组技术将针对EGFR单域抗体的序列和肿瘤穿透肽iRGD的序列构建融合蛋白,通过金属螯合层析技术得到纯化的anti-EGFR-iRGD并对其进行鉴定。利用Biacore(Biomolecular Interaction Analysis)生物分子间相互作用分析法检测融合蛋白anti-EGFR-iRGD与人EGFR的相互作用,验证了其对EGFR的靶向性;通过MALDI-TOF实验验证融合蛋白的分子量。在2D细胞、3D MCS及荷瘤裸鼠水平分别考察anti-EGFR-iRGD融合蛋白对胃癌细胞株的靶向性及穿透性;研究该融合蛋白在2D肿瘤细胞、3D MCS以及荷瘤裸鼠水平对胃癌的抗肿瘤作用。在此基础上,在3D MCS水平研究anti-EGFR-iRGD对DOX、纳米粒子渗透性影响,及对抗肿瘤药物(5-FU、CPT-11、DOX、PTX、贝伐单抗、力扑素)抗肿瘤效果的影响。研究融合蛋白与PTX联用,对胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡、细胞周期的影响,并通过测量肿瘤大小,评价融合蛋白联用PTX对人胃癌细胞株BGC823裸鼠皮下瘤模型的治疗效果。结果:利用DNA重组技术及金属螯合层析技术得到纯化的anti-EGFR-iRGD并对其进行鉴定。Biacore测定融合蛋白anti-EGFR-iRGD的KD值为7.09nM,MALDI-TOF实验得出融合蛋白的分子量为18kDa,与氨基酸序列预测结果一致、三株胃癌细胞株中摄取anti-EGFR-iRGD最多的为EGFR表达水平最高的BGC-823细胞株。anti-EGFR-iRGD对BGC-823细胞及荷胃癌细胞BGC-823的裸鼠有较好的靶向性。在穿透性实验中,anti-EGFR-iRGD可以渗透入BGC-8233D MCS及荷BGC-823的裸鼠的肿瘤组织。该融合蛋白对多种肿瘤细胞都表现出较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用,在MCS及荷瘤裸鼠水平都有较好抗肿瘤作用,并且无明显的毒副作用。除了融合蛋白单独作用外,我们又在MCS水平验证了融合蛋白anti-EGFR-iRGD可以促进小分子药物DOX(分子量0.6kDa)、大分子纳米粒子(粒径100nm-200nm)在3D MCS中的渗透性;在MCS水平,融合蛋白anti-EGFR-iRGD可以提高亲水性化疗药物(5-FU、CPT-11)、疏水性化疗药物(DOX、PTX)、分子靶向药物(贝伐单抗)的抗肿瘤效果。融合蛋白anti-EGFR-iRGD与PTX联合使用时通过抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡以及将肿瘤细胞进行细胞周期阻滞等机制发挥抗肿瘤作用,并且无明显的毒副作用。anti-EGFR-iRGD对抗癌药物有广谱的提高疗效的作用,具有较好的临床应用潜能。结论:融合蛋白anti-EGFR-iRGD具有双特异靶向性及高穿透性,并且对表达EGFR的肿瘤有较好的抗肿瘤效果;anti-EGFR-iRGD可以促进抗癌药物(不超过200nm)渗透入肿瘤,并具有提高抗癌药物抗肿瘤作用的优势,提示融合蛋白anti-EGFR-iRGD对抗癌药物有广谱的提高疗效的作用,具有较好的临床应用潜力。