研究背景及目的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染引发乙型肝炎,与肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）发生发展密切相关,有效控制HBV感染成为HCC预防和治疗的关键。尽管目前已有干扰素（interferon,IFN）、核苷类似物（nucleotide,NUC）等治疗药物,全球仍有超过2.57亿慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）患者,导致每年约70万人死于HBV相关终末期疾病。人体内存在多种模式识别受体（pattern recognition receptor,PRRs）,可以识别外源核酸,激活IFN信号通路,促进病毒清除。HBV是DNA病毒,复制过程中产生不同DNA、RNA复制中间体。然而,HBV被普遍认为是“隐形病毒”,临床及体内外实验均发现,与其他病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、仙台病毒（SeV）等相比较,HBV感染仅能激活低水平或不激活IFN信号通路。有研究表明肝细胞内缺乏DNA识别信号通路,而RNA识别通路较完整。文献已经证实HCV及RNA类似物poly（I:C）均能激活肝细胞产生高水平IFN,提示肝细胞能够识别外源RNA。那么HBV RNAs为什么不能被肝细胞识别?相关机制尚不清楚。研究报道,RNA修饰,包括N6甲基腺苷修饰（m6A）、N1甲基腺苷修饰（m1A）、甲基胞嘧啶修饰（m5C）、假尿苷修饰（Ψ）以及RNA编辑等,能够抑制模式识别受体对RNA的识别,这也是细胞自身RNA不被识别的重要原因。RNA 特异性腺苷脱氨酶（Adenosine deaminases acting on RNA 1,ADAR1）能够催化双链RNA（dsRNA）中腺苷（A）脱氨基为肌苷（I）,从而改变RNA二级结构,调控病毒复制及免疫识别过程。我们在HBV pgRNA互作蛋白中筛选到ADAR1,提示ADAR1可能与HBV RNAs相互作用,参与HBV逃逸IFN应答。但ADAR1是否编辑HBV RNAs,并参与调控肝细胞对HBV的免疫识别尚未见报道。本课题旨在研究ADAR1在HBV复制过程中的调控作用,解析HBV免疫逃逸机制,并进一步探讨ADAR1抑制剂对HBV清除的作用,以期为HBV的免疫逃逸及清除提供新的理论基础。主要研究方法及结果如下:第一部分肝细胞不能有效识别HBV感染HBV被普遍认为是“隐形病毒”,但也有研究表明RIG-I能够识别HBV pgRNA激活低水平IFN-λ表达。为明确HBV感染是否激活肝细胞内的IFN应答,本研究首先采用多种HBV感染肝细胞模型,检测细胞内IFNs水平。1.HBV感染或转染激活肝细胞产生低水平IFNs收集HBV病毒颗粒体外感染HLCZ-01、HepG2NTCP细胞系及原代肝细胞（primary hepatocytes,PHH）,在感染不同时间点检测IFNs mRNA水平。结果显示,HBV感染仅激活肝细胞内低水平IFNs表达。为了排除HBV感染效率低的影响,利用HBV表达质粒HBV1.1（D型）、HBV1.3（C型）转染HepG2细胞,同上检测IFNs mRNA。结果表明,即使HBV复制水平（pgRNA）很高的情况下,HBV也不能有效激活肝细胞内IFNs表达,并且该现象与HBV基因型无关。2.肝细胞内RNA受体表达丰富,能够识别外源RNA为了了解HBV感染的肝细胞中IFN低应答是否与细胞上PRR表达情况有关,RT-qPCR 检测肝癌细胞系HepG2、Huh7、HLCZ-01、HepG2.2.15 及 PHH 细胞内PRRs表达。结果显示,与单核细胞THP-1相比,肝细胞内DNA受体cGAS、STING、IFI16等表达量较低,RNA受体包括RIG-I、MD45、TLR3等表达量较丰富。进一步体外刺激实验结果显示,DNA类似物小牛胸腺DNA（CT-DNA）以及STING激动剂环二核苷酸（2’,3’-cGAMP）不能激活肝细胞内高水平IFNs表达;但RNA类似物poly（I:C）及RNA病毒水疱性口炎病毒（VSV）显著激活HepG2细胞内IFN信号通路。上述结果证实,肝细胞内RNA识别受体表达丰富,能够识别外源RNA激活IFN通路。3.体外转录的HBV pgRNA能够激活肝细胞IFN信号通路为了确认HBV RNAs能否被肝细胞PRRs识别,体外转录获得HBV 3.5kb pgRNA,恢复二级结构并去磷酸基团后转染PHH及HepG2细胞。RT-qPCR结果显示,体外转录的HBVpgRNA呈剂量依赖性激活PHH及HepG2细胞内IFN信号通路,提示HBV感染过程中病毒RNAs能逃逸肝细胞内固有免疫识别。第二部分ADAR1通过编辑HBV RNAs抑制肝细胞IFN应答促进HBV复制一、ADAR1编辑HBV RNAs干扰肝细胞对HBV的免疫识别为探究HBV RNAs逃逸宿主免疫的机制,利用pgRNA-pull-down数据寻找HBV RNAs互作蛋白,并解析其在HBV RNAs免疫识别中的调控作用。1.ADAR1依赖于其dsRNA结合域结合HBV RNAs对已发表文献中的HBV pgRNA互作蛋白数据库进行生物学功能富集分析,发现RNAprocessing及Infectious disease通路相关蛋白显著富集,且其中均包含ADAR1。RIP 及 RNA pull-down 实验证明 ADAR1 能够与 HBV RNAs 结合,免疫荧光（IFA）)确定ADAR1与HBV pgRNA共定位。进一步构建ADAR1系列截短体以及点突变体,与HBV1.3共转染Huh7细胞,RIP实验证实ADAR1结合HBV RNAs依赖于其dsRNA结合域。2.ADAR1编辑HBV RNAs促进其逃逸固有免疫识别为明确ADAR1能否编辑HBVRNAs,我们构建多西环素（Dox）诱导ADAR1敲低的HepG2NTCP-Tet-shADAR1细胞系用于HBV感染,RNA-seq分析显示,ADAR1广泛编辑细胞RNA及HBV RNA,主要编辑类型为A-G、U-C。GSEA富集分析表明,ADAR1敲除后IFN信号通路显著富集,IFNs及ISGs表达升高。与对照细胞相比较,HBV感染显著激活HepG2NTCP-Tet-shADAR1细胞IFN通路。同样,ADAR1抑制剂8-azaadnosine（8-aza）处理的HepG2细胞进行HBV感染或转染也有效激活IFN表达,提示ADAR1抑制肝细胞内HBV感染诱导的IFN应答。为确认ADAR1通过编辑HBVRNAs调控IFN表达,通过对比分析ADAR1敲除与对照细胞RNA-seq数据,确定ADAR1介导的pgRNA突变位点,并构建ADAR1编辑HBV的质粒（HBV1.3-edited）,转染后检测IFNs表达。结果发现,与 HBV1.3 相比较,HBV1.3-edited 转染不能有效激活 HepG2NTCP-Tet-shADAR1细胞中IFN表达。同样地,由HBV1.3-edited体外转录的pgRNA-edited几乎丧失了激活HepG2细胞IFN信号通路的能力。进一步RIP实验结果显示,ADAR1明显抑制RNA受体RIG-I、MDA5与HBV RNAs的结合,且该作用依赖于其RNA编辑活性。在ADAR1敲低的HepG2NTCP-Tet-shADAR1细胞中共转染HBV1.3及MAVS siRNA,发现干扰MAVS后消除了 ADAR1对HBV激活IFN通路的抑制作用。综上,我们的结果显示,ADAR1编辑HBV RNAs,进而抑制肝细胞PRRs识别HBV RNAs及IFN应答。二、ADAR1依赖其编辑作用促进HBV复制HBV不同感染模型,检测ADAR1对HBV复制的影响。1.ADAR1促进HBV转录、复制在不同HBV复制模型（HBV 1.3转染Huh7细胞、HBV感染Huh7NTCP和HepG2NTCP及HepG2.2.15细胞）中,过表达或敲低ADAR1,ELISA检测HBsAg/HBeAg、RT-qPCR 检测pgRNA、Western blot 检测 HBc/HBx/Pol、Northern blot检测HBV RNAs。结果显示,ADAR1过表达显著促进病毒蛋白表达以及HBV RNAs的转录,敲低ADAR1表达显著抑制HBV复制。2.ADAR1促进HBV复制依赖于其编辑作用为明确ADAR1促进HBV复制的关键功能域,构建ADAR1不同功能域点突变体及截短体,分别与HBV1.3同时转染Huh7细胞。结果表明,与介导HBV RNAs编辑的功能域相同,ADAR1促进HBV复制依赖于其dsRNA结合及编辑域。与此相对应,8-aza抑制ADAR1活性后ADAR1对HBV复制的促进作用显著减弱。3.ADAR1调控HBV复制依赖于其对IFN通路的调节作用为明确ADAR1促进HBV复制是否依赖于IFN通路,在HBV感染ADAR1敲低的HepG2NTCP-Tet-shADAR1细胞中,采用IFN中和抗体或siMAVS预处理,结果显示,阻断IFN及ISG通路有效拯救敲低ADAR1对HBV的抑制作用。综上,ADAR1通过调节IFN通路促进HBV复制。三、ADAR1抑制剂激活肝脏固有免疫应答促进HBV清除ADAR1在不同HBV感染细胞模型中抑制免疫识别通路并促进HBV复制,提示ADAR1抑制剂在HBV治疗中的潜在价值。因此进一步在小鼠模型中进行验证。1.ADAR1抑制剂促进HBV小鼠模型清除病毒6-8周龄雄性C57BL/6小鼠高压水动力注射pAAV-HBV1.2表达质粒,高压4d后每天腹腔注射8-aza（2mg/kg B.W.）,恩替卡韦（ETV）灌胃处理组（0.1mg/kg B.W.）为阳性对照,药物处理后每三天采血检测血清HBsAg、HBV DNA水平,药物处理15d后收集血清及肝脏组织。结果表明,8-aza连续处理9d显著下调小鼠血清HBsAg、HBVDNA水平,并抑制肝组织内pgRNA转录水平及HBcAg蛋白水平。2.ADAR1抑制剂激活肝脏免疫反应流式检测结果显示,HBV感染小鼠肝脏中T细胞比例显著降低,Treg 比例升高,且CD8+T、NK细胞分泌TNF-α、IFN-γ的能力明显下降。8-aza处理显著上调小鼠肝脏中T细胞比例,下调Treg、MDSC细胞比例,并促进肝脏CD8+T、NK细胞功能。RT-qPCR结果进一步证实,8-aza处理显著促进肝脏内IFNs（Ifnb1、Ifnl3、Ifng）、ISGs（Oas1、Mx1）以及促炎性因子Tnfa表达,激活肝脏免疫应答。第三部分HBx促进ADAR1表达1.HBV感染促进ADAR1表达HBV能调控多种宿主基因表达来调控自身复制。为明确HBV对ADAR1表达的影响,免疫组化和RT-qPCR检测肝癌癌旁组织中ADAR1表达与HBV复制水平相关性,发现ADAR1在HBV阳性标本（HBVDNA＞1000 copies/mL）中表达明显高于HBV阴性标本（HBV DNA≤1000 copies/mL）,且ADAR1表达与HBcAg及pgRNA水平均显著正相关。体外不同HBV感染细胞模型和HBV转基因小鼠肝组织中也发现ADAR1转录和蛋白水平均显著升高。综上,HBV感染明显上调ADAR1表达。2.HBx促进ADAR1表达为明确促进ADAR1表达的关键病毒蛋白,分别用HBV不同组分及HBV1.3表达质粒与ADAR1启动子报告质粒共转染Huh7细胞。Western blot及双荧光素酶实验结果显示,除HBc外,HBV及其各组分均不同程度的促进了 ADAR1转录和蛋白表达,其中HBx的促进作用最为显著,并且呈现剂量依赖性。HBx沉默表达后,HBV对ADAR1的促进作用消失。3.HBx通过YY1反式激活ADAR1转录为了解析HBx调控ADAR1转录的分子机制,构建ADAR1启动子系列截短体报告质粒。双荧光素酶报告实验结果显示,HBx调控ADAR1启动子活性依赖于（-442～-779）区间。TRANSFAC转录因子结合位点预测显示YY1结合该区域的可能性最高。利用siRNA敲低YY1,或敲除ADAR1启动子报告质粒中YY1结合序列后,结果发现,HBx对ADAR1启动子的激活作用完全消失,表明HBx调控ADAR1表达依赖于转录因子YY1。结论及意义:本研究首次发现ADAR1编辑HBVRNAs,从而抑制肝细胞识别HBVRNAs,抑制IFN应答。HBx通过转录因子YY1促进肝细胞ADAR1表达,进一步提高肝细胞固有免疫识别的阈值,促进自身的免疫逃逸及病毒复制。抑制ADAR1有效恢复肝脏抗病毒功能,促进HBV的清除。我们的研究揭示了 HBV逃逸肝细胞固有免疫识别的新机制,为HBV治疗提供了新靶点。