[目的]　　目前流感防治主要依靠疫苗和抗流感药物。但是由于流感病毒为多节段单股负链RNA病毒，具有极强的重组变异和抗原漂移能力;且从鉴定分离出具有大流行可能的流感病毒新毒株，到生产出首批获批准的疫苗需要大约5至6个月时间，严重制约了流感疫苗的免疫保护作用和时效性。因此，对可能大规模爆发的流感疫情来讲，药物治疗仍是控制流感病毒传播的最好手段。但是随着药物治疗相关的耐药性突变株的出现，加之药物的不良反应、病人的耐受性等诸多因素的影响，亟待寻找新的药物靶标，发展新型抗流感病毒药物，解决目前流感病毒耐药的问题。在流感病毒基因组中，编码PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守，且流感病毒编码的是RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRP)，与宿主编码的参与基因转录的DNA依赖的RNA聚合酶不同。因此本研究拟建立以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗流感病毒药物筛选模型，发展新型抗流感药物，其不仅不易随着病毒株的变异而发生改变，且对人体的RNA聚合酶也无影响。　　[方法]　　1.将萤火虫荧光素酶luc基因编码序列的反向互补序列两端引入流感病毒H1N1（A/WSN/33）M节段的非编码区(5 UTR和3UTR)，将这段人工构建的序列插入到pHH21载体的Ⅰ型RNA聚合酶启动子/终止子区，构建重组质粒pFlu-luc。之后，将重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α，挑选阳性克隆经PCR初步鉴定后，进行测序。　　2.将表达流感病毒RdRP的(pHW181-PB2、pHW182-PB1、pHW183-PA、pHW185-NP)4个质粒或缺失其中任何一种质粒后与pFlu-luc共转染293T细胞，转染后48h收集细胞，进行荧光信号检测和Western Blotting分析，验证构建的pFlu-luc质粒是否由流感病毒RdRP特异启动。　　3.将细胞模型中的5质粒，进行浓度梯度转染，每种质粒用量从800ng开始2倍比稀释至1.56ng为止，共转染48h后，进行荧光信号检测，以确定各质粒转染量对荧光信号的影响。　　4.确定了质粒转染量后，分别在转染后10h、12h、16h、24h、36h和48h收集细胞，检测荧光信号强度，判断荧光素酶在何时表达量达到最大，以确定细胞收集和荧光素酶活性测定的最适时间。　　5.为了验证模型的特异性，拟选用四种已知作用靶点的抗流感药物作用于该模型。在药物作用于细胞模型之前，首先用CCK-8法检测细胞毒性:即分别观察不同药物浓度的利巴韦林，盐酸金刚烷胺，磷酸奥司他韦和扎那米韦对293T细胞增殖抑制率的变化，确定药物的CC50;然后再进一步检测药物对甲型流感病毒（H1N1/WSN/33）的敏感性，确定药物的IC90。　　6.按照药物IC90选取用量，分别加入抗流感药物:利巴韦林、盐酸金刚烷胺、磷酸奥司他韦和扎那米韦作用于该模型，判断药物对流感RdRP活性的影响，评价模型的特异性。　　7.评价药物筛选模型的稳定性:用10cm细胞培养皿进行转染，转染分两组进行:共转染5质粒的细胞为阳性对照组，以只转染质粒pFlu-luc的细胞作为阴性对照组。转染12h后，用胰酶消化，转接种于96孔板，再培养36h后检测荧光素酶活性。计算Z因子=1-(3×阳性对照组相对荧光值SD+3×阴性对照组相对荧光值SD)/（阳性对照组相对荧光值平均值-阴性对照组相对荧光值平均值）。　　[结果]　　1.PCR扩增和序列测定结果显示，人工构建两端带有流感病毒M节段5UTR和3UTR的荧光素酶编码序列反向互补RNA序列，成功插入到pHH21载体的Ⅰ型RNA聚合酶启动子/终止子区，从而得到流感病毒RdRP活性依赖的荧光素酶表达质粒pFlu-luc。　　2.荧光信号检测结果表明，只有当表达流感病毒RdRP的(pHW181-PB2、pHW182-PB1、pHW183-PA、pHW185-NP)4个质粒与pFlu-luc共转染293T细胞后，荧光信号才有显著增强(p＜0.01)，说明荧光素酶此时得以表达。Western Blotting检测结果与上述结果一致。实验结果证实了pFlu-luc中Luc的表达特异性地依赖于流感病毒RdRP活性。　　3.将细胞模型中的5质粒，进行浓度梯度转染，随着质粒转染量的增加，荧光强度逐渐升高，当每种质粒转染量增加到100ng后，荧光强度基本稳定。结果表明，当表达PA、PB1、PB2、NP和Luc蛋白的5质粒共转染293T细胞，每种质粒转染量为100ng时，荧光强度即可达到最大值。　　4.将细胞模型中的5质粒共转染293T细胞，分别在转染后10h、12h、16h、24h、36h和48h收集细胞，检测荧光信号强度。实验结果显示:转染后36h收集细胞，测得的荧光信号最强，说明此时细胞内荧光素酶的表达量达到最大。　　5.实验测得:利巴韦林CC50为830ug/mL，在21.82ug/mL浓度以下无细胞毒性;IC90为44.7 umol/L。金刚烷胺CC50为454.55ug/mL，药物的最大无毒作用浓度为90.91ug/mL; IC90为149 umol/L。奥司他韦CC50为1700nM，在568nM浓度以下无细胞毒性;IC90为90 nmol/L。扎那米韦药物的最大无毒作用浓度在909 nmol/L以上;IC90为0.15 nmol/L。　　6.四种药物作用结果表明，利巴韦林处理组荧光信号较对照降低了80％(P＜0.01)，而盐酸金刚烷胺、磷酸奥司他韦和扎那米韦处理后荧光信号没有降低，该结果与四种药物报道的靶点相吻合，初步评价本研究建立的以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗病毒药物筛选模型具有专一性。　　7.Z因子是评价高通量筛选模型稳定性的一个重要参数。当Z因子大于0.4时，则认为该模型较稳定，适用于高通量药物筛选。实验得出本模型的Z因子为0.64，符合高通量筛选的要求。　　[结论]　　本研究通过构建流感病毒RdRP活性依赖的荧光素酶报告系统，在细胞水平上建立了以流感病毒RNA聚合酶为靶点的抗流感药物筛选模型，通过检测荧光强度即可定量分析流感病毒RdRP活性。通过使用四种已知作用靶点的药物作用于该模型以及模型Z因子分析证实该方法特异性好，检测灵敏度高，操作简便，可作为高通量筛选模型。