研究背景肝癌是第六常见的癌症,同时致死率排名第三,每年有超过700000人被诊断为肝癌,平均每10万人的发病人数为16。肝癌患者的五年生存率约为5-9%,而导致生存率低的原因主要是因为肝癌发现时多数已经处于晚期。通常情况下约70-90%肝癌的发生都与慢性肝脏内疾病的发生有关,大约有80%的肝癌发生在东亚以及撒哈拉以南非洲地区,而这主要与慢性乙肝病毒感染以及黄曲霉素B的摄入有关。而在北美,欧洲以及日本,慢性丙肝病毒感染是肝癌发生的主要危险因素,其次是饮酒。肝癌的发生是一个复杂的过程,与多种突变以及信号通路改变有关,其中最常见的基因突变是抑癌基因TP53的失活突变,大约有20-40%的肝癌病人有TP53的基因突变,并且其突变频率与肝癌的发展阶段有关。CTNNB1,编码βcatenin,发生突变的概率约为25%,主要在HCV相关的肝癌中出现。同时在染色体1q,6p,8q,17q和20q发生的基因扩增以及4q,8p,11q,13q,16q和17p的片段缺失突变在肝癌中较为常见,它们影响了一些重要的致癌基因和抑癌基因。表皮生长因子受体EGFR及Ras信号通路在超过50%的肝癌患者中都被激活,而mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路在约40-50%的肝癌中都因上游抑癌基因PTEN的失活而激活。MicroRNA是短链非编码的RNA,长度约为18-25个核苷酸,通常与调控的mRNA的3’端调控区域或者5’端UTR配对。MicroRNA结合到目标mRNAs后会导致目标mRNA的转录抑制,或者促进mRNA的降解,从而导致一个迅速且敏感的基因表达调控。MicroRNA己经被证明影响超过30%人类基因的表达,并且超过60%的mRNA在3’UTR有microRNA预测的结合位点。同一个microRNA可以调控多个基因的表达,而一个基因也可以被多个microRNA调控,并且microRNA的表达可以是组织或者器官特异性的。近年来越来越多的数据表明microRNA可以作为癌基因或者抑癌基因发挥作用,直接或间接的参与癌症相关的信号通路调节。MicroRNA参与调节许多重要的生理过程,对维持正常肝脏功能以及在肝脏疾病中有重要作用,并且在肝癌中存在一系列的microRNA表达下调,表明他们可能作为潜在的抑癌基因,而重新表达那些抑癌的microRNA可以导致细胞周期受阻,增加细胞凋亡,降低肿瘤血管生成和转移。MicroRNA的产生以及靶向目的基因都是非常序列特异性的,在microRNA或者microRNA靶向序列的突变可能对microRNA的功能产生深远影响。序列分析表明microRNA以及其靶向序列在进化上是高度保守的,此外microRNA基因的SNPs十分少见。这些证据表明在遗传选择的压力上,microRNA序列中出现的SNPs可能是具有功能的。理论上microRNA相关的SNPs可以通过两种机制影响肿瘤细胞。第一,突变导致microRNA功能失活从而导致抑癌的microRNA失活;第二,突变导致microRNA激活而导致致癌的microRNA表达增强。MicroRNA在产生过程中,需要Drosha和Dicer进行连续的剪辑,这一过程很大程度上依赖于前体RNA的适当折叠成一个颈环状结构,而在pri-microRNA和pre-microRNA发生序列变化可能会导致二级结构改变,从而抑制或增强pri-microRNA 的剪辑效率,这些 SNP 在 pri-microRNA,pre-microRNA 或者成熟的microRNA中,可以降低或增强microRNA的功能。SNP也可以间接影响microRNA,例如SNP在microRNA的启动子区域,影响其翻译,或者SNP在mRNA中导致microRNA的靶向位点受到破坏。MicroRNA的SNP也可以与癌症的发病危险性,预后等相关,例如在肝癌中IL1A基因3’ UTR区域的rs3783553 SNP会产生一个新的miR-122和miR-378的结合位点,从而抑制IL1A的表达,降低抗肿瘤的免疫反应,增加患肝癌的危险性;在βTrCP(β-transducin repeat-containing protein)3’UTR 的一个插入缺失突变会导致miR-920的结合位点破坏,从而增加βTrCP的表达,导致NF-kB入核而激活抗凋亡基因而促进肿瘤细胞存活。SET8基因的3’ UTR区域的一个SNP与肝癌患者生存提高相关,对病人组织进行免疫组化染色发现,SET8的SNP降低了 SET8的蛋白表达,而该SNP会产生一个miR-502的靶向位点,而抑制SET8会激活p53的抗凋亡以及检验点功能。研究目的和意义本课题主要的研究目的包括:(1)探究miR-146a在肝癌病人肿瘤组织、癌旁组织以及肝癌细胞系中的表达变化,是否存在表达异常,是上调或者下调?(2)采用肝癌细胞系作为模型,探究miR-146a对肝癌细胞的作用,是否能够影响细胞增殖,集落形成,细胞迁移或者裸鼠成瘤能力等。(3)测定miR-146ars2910164位点SNP在肝癌人群和健康人群对照中的基因型分布,分析该SNP与肝癌易感性之间的关系。MiR-146家族的成员包括miR-146a和miR-146b,在THP-1细胞受到LPS刺激后会受到激活而导致miR-146a和miR-146b表达增加,并且是NF-kB信号通路依赖的。MiR-146a是通过靶向IRAK-1而导致负反馈调节抑制NF-kB信号通路,从而抑制乳腺癌和胰腺癌细胞系的侵袭和转移。在pre-miR-146a的一个SNPrs2910164G＞C被证明是乳头状甲状腺癌的危险因素,而在接下来的研究表明rs2910164 SNP与前列腺癌,食管癌的发病相关联。在最近的一个研究中rs2910164 SNP与膀胱癌的发病下降以及复发减少有关。功能研究表明miR-146a rs2910164 G＞C突变可以通过改变Drosha调节的剪辑过程而降低miR-146a表达。研究表明miR-146的低表达与雄性激素非依赖的前列腺癌相关,而rs2910164 SNP与荷尔蒙耐药的前列腺癌相关,因此可以推测miR-146a在前列腺癌中有重要作用。肝癌中同样存在miR-146a的异常表达,可能作为一个抑癌基因发挥作用,因此本文通过对肝癌病人肿瘤组织和癌旁组织进行miR-146a表达检测进行验证,同时采用低表达miR-146a的肝癌细胞系模型,通过转染表达miR-146a的质粒上调miR-146a的表达,研究上调miR-146a表达后细胞系细胞增殖,侵袭,集落形成以及裸鼠成瘤能力变化,检测miR-146a在肝癌中是否具有抑癌作用,此外本文通过对188例肝癌患者以及186例健康人miR-146ars2910164 SNP基因型进行检测,研究该SNP与肝癌易感性的相关性。通过上述研究可以对miR-146a在肝癌中的表达变化,是否作为抑癌基因发挥作用,以及其rs2910164 SNP与肝癌易感性进行检测,为肝癌发生发展的分子机制以及治疗提供理论依据。研究内容和方法(1)病人组织miR-146a表达检测:收集肝癌病人的肿瘤组织与癌旁组织,提取总RNA,采用荧光定量PCR对miR-146a表达进行检测,以癌旁组织作为对照分析肝癌病人肿瘤组织miR-146a的表达变化,并将肝癌病人按照肝癌的临床分期进行分组,分析miR-146a表达变化与肝癌病人的临床分期是否具有相关性。(2)肝癌细胞系miR-146a表达检测:选择一系列肝癌细胞系,培养后提取总RNA,采用荧光定量PCR对肝癌细胞系miR-146a表达变化进行检测,以正常肝癌细胞系作为对照。选择miR-146a较低的肝癌细胞系作为模型,通过构建miR-146a表达载体,在低表达miR-146a的肝癌细胞系中上调miR-146a表达,研究细胞功能变化。(3)细胞增殖测定:将HepG2和SMMC-7721细胞按照2000个/孔铺板到96孔板中,培养24h后进行miR-146a慢病毒感染,采用PLKO.1慢病毒以及未感染病毒的细胞作为对照,不同时间点对进行活细胞数目检测,分析细胞生长变化。(4)细胞集落形成能力检测:将HepG2和SMMC-7721细胞感染miR-146a慢病毒,并以感染PLKO.1慢病毒和不感染病毒的亲代细胞作为对照进行软琼脂集落形成测试,软琼脂集落形成实验上层胶浓度为0.4%,下层胶为0.6%,每孔接种细胞细胞数为4000个,在培养3周后采用结晶紫染色并用显微镜拍照计数。(5)细胞侵袭能力变化检测:将HepG2和SMMC-7721细胞感染miR-146a慢病毒,并以感染PLKO.1慢病毒和不感染病毒的亲代细胞作为对照。将细胞无血清饥饿处理过夜并消化成单个细胞,采用含有BSA的无血清培养基将细胞重悬,并将1×105细胞加入24孔板的Transwell小室,并在24孔板下室加入500ul含有FBS的DMEM完全培养基,37摄氏度培养24h后采用4%多聚甲醛将细胞固定并采用吉姆萨染液染色拍照。(6)裸鼠成瘤能力变化检测:将HepG2和SMMC-7721细胞感染miR-146a慢病毒,并以感染PLKO.1慢病毒的细胞作为对照,取8周龄雌性BABL/C裸鼠进行肿瘤细胞接种,在每只小鼠右腋下接种3×106个感染了 PLKO.1慢病毒的细胞,在每只小鼠左腋下接种3×106个感染了 miR-146a慢病毒的细胞,并在接种肿瘤后一周开始肿瘤大小测量,每隔3天测量一次,并在HepG2或SMMC-7721肿瘤细胞接种四周后处死小鼠并将肿瘤取出,测量大小,称重,拍照并记录数据。(7)Western blot检测相关信号通路蛋白:将HepG2和SMMC-7721细胞按照5×105/孔铺板在六孔板中,感染miR-146a慢病毒,并以感染PLKO.1慢病毒的细胞作为对照,培养72h后收蛋白样品,对HepG2和SMMC-7721细胞pAkt,p-P38MAPK,PCNA以及NF-kB p65表达进行检测。(8)miR-146ars2910164 SNP位点基因型分布检测:采集188位肝癌病人以及186位健康人的外周血,采用QIAampDNA MiniKit试剂盒对DNA提取,然后采用PCR扩增miR-146a基因片段并送样测序检测,分析该SNP与肝癌发生的相关性。研究结果本文对肝癌病人肿瘤组织、癌旁组织以及肝癌细胞系miR-146a表达进行了检测,并在肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721中上调miR-146a的表达,然后对细胞增殖、侵袭、集落形成、裸鼠成瘤以及相关信号通路蛋白进行检测,并分析miR-146ars2910164 SNP与肝癌的易感性。结果如下:(1)肝癌病人肿瘤组织的miR-146a表达水平与癌旁组织的表达水平存在显著性差异,肝癌患者肿瘤组织的miR-146a表达水平明显低于癌旁组织,差异具有统计学意义。通过计算得到miR-146a表达的中位数,肝癌组织为3.72±2.5,癌旁组织为9.55±5.3,癌旁组织miR-146a表达水平是肝癌组织miR-146a平均值的2.57倍。将患者根据肝癌临床级别进行分类,结果表明,miR-146a表达水平与肝癌病人的临床分期相关,临床分期(Ⅲa和Ⅲb)越高的病人则其miR-146a表达水平则较低,而临床分期(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa和Ⅱb)较低的病人则miR-146a表达水平较高(2)miR-146a在正常肝细胞系L02以及LM3中表达较高,而在肝癌细胞系HepG2,SMMC-7721和QGY-7701中表达较低,表明部分肝癌细胞系如HepG2,SMMC-7721和QGY-7701的miR-146a表达水平相对于正常的肝脏细胞系L02相比,呈明显下调趋势。(3)采用HepG2和SMMC-7721细胞作为模型并构建miR-146a表达载体,荧光定量PCR验证miR-146a表达成功。在HepG2和SMMC-7721细胞在上调miR-146a表达过后,与亲代细胞或者感染空载体PLKO.1病毒的细胞相比,其细胞增殖明显受到抑制,同时软琼脂集落形成能力明显受到影响,形成的集落数明显减少,在细胞侵袭实验中,穿过Transwell小室染色呈阳性的细胞数目明显变少,其细胞侵袭能力明显受到抑制,成瘤能力明显下降,其肿瘤平均大小要明显低于对照组。采用Western blot 对 HepG2 和 SMMC-7721 细胞上调 miR-146a 表达后 p-P38MAPK,pAkt,NF-kBp65,PCNA 蛋白进行检测,结果表明 p-P38MAPK,pAkt,NF-kBp65,PCNA表达均明显下降,表明miR-146a上调表达对细胞增殖以及PIK3K/Akt以及NF-kB信号通路均有影响。(4)肝癌组和健康人对照组之间miR-146ars2910164位点基因型差异具有统计学差异,rs2910164 位点 GC(OR=1.99,95%CI 1.27-3.11,P=0.003)或CC(OR=3.3,95%CI 1.72-6.32,P=0.0003)基因型携带者患肝癌的危险性明显高于rs2910164位点GG基因携带者。肝癌组和健康人对照组基本特征分析,HBV感染、肝癌家族史、饮酒因素存在相关性,并且miR-146ars2910164位点多态性与肝癌病人临床分期,肿瘤大小,组织细胞类型,转移情况,血管及淋巴浸润情况不存在相关性。结论肝癌患者肿瘤组织的miR-146a表达水平明显低于癌旁组织,并且与病人的临床分期相关,因此miR-146a表达水平变化可能作为肝癌患者潜在的预后指标。MiR-146a作为抑癌基因在肝癌中发挥作用,上调其表达可以抑制肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞增殖,集落形成,细胞侵袭以及裸鼠成瘤能力,其致癌作用可能与下调p-P38MAPK,pAkt,NF-kB p65和PCNA表达有关。MiR-146a rs2910164位点GC或CC基因型携带者患肝癌的危险性明显高于rs2910164位点GG基因型携带者,肝癌组和健康人对照组基本特征分析,HBV感染、肝癌家族史、饮酒因素存在相关性,并且与肝癌病人临床分期,肿瘤大小,组织细胞类型,转移情况,血管及淋巴浸润情况等因素不存在相关性。