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【目的】FXS是最常见的遗传性智力低下疾病之一，其发病的主要原因是FMR1基因5′非翻译区的CGG重复序列异常扩增，导致FMRP的生成减少或缺失。FMRP在脑组织的表达量很高，作为一种选择性RNA结合蛋白，FMRP在各种刺激的诱导下于转录后水平调控着一系列靶mRNA的转运和翻译。FMRP对靶基因的异常调控，特别是对与突触形成与可塑性调节相关的靶基因的异常调控，可能是FXS的分子发病机制。既往研究表明，FMRP通过与Dicer及AGO蛋白相互作用以及与成熟miRNA相互结合，从而参与miRNA作用通路。通过miRNA芯片检测及荧光定量PCR验证的方法，先前发现了一部分成熟miRNAs及其相应的前体 miRNAs在 Fmr1敲除小鼠海马组织中表达上调，而其相应的原始miRNAs表达则基本不变，提示 FMRP可能作用于 pri-miRNA的加工过程。DROSHA酶作为一种RNase III，具有核酸内切酶活性，DGCR8蛋白则具有双链RNA结合域，可以识别并结合双链 RNA，两者在细胞核内通过相互作用形成DROSHA-DGCR8复合体，将pri-miRNA切割成pre-miRNA，在miRNA加工、成熟过程中起着关键性的作用。因此，推测Fmr1敲除小鼠中DROSHA和/或DGCR8的表达异常可能是导致miRNA表达谱改变的原因。本研究通过检测FVB小鼠海马组织及小鼠Neuro-2a细胞中miRNA成熟过程关键酶DROSHA和DGCR8的表达水平，研究FMRP对该蛋白表达的调控机理，以期揭示FMRP参与miRNA加工过程中的分子机制，为进一步认识FXS发病机制提供新的理论依据。 【方法】 1、提取FVB小鼠海马组织总RNA、总蛋白及核蛋白，采用qRT-PCR、Westernblot在mRNA及蛋白水平上检测Fmr1 WT鼠及KO鼠海马组织中DROSHA及DGCR8的表达情况； 2、利用FMRP过表达及干扰表达质粒（以及相应对照质粒）转染Neuro-2a细胞，转染48小时之后根据不同目的对细胞进行相应处理，以分析 FMRP对DROSHA表达的调控。 ①检测FMRP对Drosha mRNA及蛋白水平的影响：提取上述细胞总RNA及核蛋白之后，分别进行qRT-PCR、Western blot检测； ②检测FMRP对Drosha mRNA稳定性的影响：采用放线菌素D处理上述细胞，处理0、3、6 hr后提取细胞总RNA后进行qRT-PCR检测； ③检测FMRP对Drosha mRNA翻译效率的影响：采用放线菌酮处理上述细胞，裂解细胞后采用线性蔗糖梯度离心法分离多聚核糖体，通过 qRT-PCR对多聚核糖体（3个核糖体以上）结合的mRNA进行分析； 3、利用FVB小鼠海马组织以及过表达FMRP的Neuro-2a细胞进行RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）实验，检测FMRP与Drosha mRNA在体（in vivo）结合的情况；接着，采用FVB小鼠海马组织浆蛋白以及纯化GST融合FMRP蛋白进行RNA电泳凝胶迁移实验（RNA-EMSA），进一步寻找FMRP与Drosha mRNA的具体结合序列； 4、构建psiCHECK-pri-miRNA质粒，与过表达或干扰表达FMRP质粒共转染Neuro-2a细胞，转染48 hr后利用双荧光素酶报告基因系统检测FMRP对DROSHA酶活性的影响。 【结果】 1、DROSHA蛋白水平在Fmr1 KO鼠海马组织中较WT鼠明显下降，差异有统计学意义，而DGCR8蛋白、DroshamRNA、Dgcr8mRNA水平在Fmr1KO鼠及WT鼠海马组织中的差异均无统计学意义； 2、过表达FMRP后细胞DROSHA蛋白水平明显上升，相反，干扰FMRP表达后细胞DROSHA蛋白水平明显下降，差别均有统计学意义，然而，过表达及干扰表达FMRP后细胞DroshamRNA水平均无明显改变，提示FMRP在转录后水平上上调DROSHA表达； 3、与相应的对照组相比，FMRP过表达与干扰表达后细胞Drosha mRNA的半衰期无明显改变，提示FMRP不影响Neuro-2a细胞DroshamRNA的稳定性； 4、与对照组相比，过表达 FMRP后细胞多聚核糖体结合的 Drosha mRNA量明显增多，差别有统计学意义，证实FMRP提高Neuro-2a细胞Drosha mRNA的翻译效率； 5、采用FVB小鼠海马组织进行RIP实验，结果可见Fmr1 WT鼠海马组织中沉淀的DroshamRNA量较KO鼠明显增多（约3倍），差别有统计学意义；进一步采用Neuro-2a细胞进行该实验，结果显示过表达FMRP的Neuro-2a细胞中沉淀的Drosha mRNA量较对照组明显增多（约2倍），差别有统计学意义，证实了FMRP可以在体（invivo）结合DroshamRNA； 6、经生物信息学分析后挑选11段Drosha RNA探针与FVB小鼠海马组织浆蛋白进行RNA-EMSA实验，发现C5、C6、C7、U1段探针存在阻滞条带，提示可以与浆蛋白结合；但上述4段探针与Fmr1 WT鼠及KO鼠海马组织浆蛋白结合条带的亮度无明显差别；进一步将上述4段探针与纯化GST融合FMRP蛋白进行实验，则未见特异性阻滞条带，说明本研究未能找到 Drosha mRNA与FMRP结合的具体位置； 7、双荧光素酶报告基因系统检测结果可见，与相应的对照组相比，Neuro-2a细胞过表达与干扰表达FMRP后5种psiCHECK-pri-miRNA载体的荧光素酶活性（hRluc/ hluc+）均无明显改变，说明FMRP表达水平的改变不影响DROSHA酶切割5种pri-miRNA的活性。 【结论】本研究证实FMRP通过与Drosha mRNA结合，提高Drosha mRNA的翻译效率，从而上调DROSHA蛋白表达，提示FMRP可能通过RNase IIIDROSHA参与调控 miRNA的成熟加工过程；而 Fmr1基因敲除小鼠中FMRP缺失下调DROSHA表达，可能影响到miRNA成熟过程，进一步影响到一系列靶基因表达，这很有可能是FXS发病的重要因素。