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转基因动物乳腺生物反应器制药已经走向产业化,在国外,部分医用蛋白已经进入临床应用。由于哺乳动物乳腺上皮细胞对重组蛋白的加工、修饰作用,该方法生产的药用蛋白生物活性高。血栓性疾病严重威胁到了人类的生命健康,其具有很高的发病率、死亡率。溶栓药是目前临床上治疗血栓疾病比较常用的方法。重组人组织纤溶酶原激活剂(rhPA)是第三代溶栓药物,有很好的溶栓效果,但均为原核表达产品,并且无自主知识产权。本实验设计了新颖rhPA乳腺特异性表达载体,用于制备双位点整合或单位点转基因兔。获得的乳腺特异性rhPA表达产物经纯化和动物试验表明已经获得了乳腺特异性高表达转基因兔和具有高效溶栓活性的rhPA,为创制具有自主知识产权的高效新颖溶血栓生物药奠定了基础。构建载体的基本元件为实验室保存的PCL-25/LTF-Neo和自行设计的rhPA基因片段。PCL-25/LTF-Neo通过Nhe Ⅰ酶切,切胶回收获得Neor基因片段,PCL-25/rhPA质粒用Nhe Ⅰ酶切胶回收获得线性化的片段。将线性化的PCL-25/rhPA片段和Neor基因片段用T4 DNA连接酶连接,获得PCL-25/rhPA-Neo质粒。将其用Sal I、 Not I双酶切,回收出去除原核部分的18kb的条带用于显微注射制备转基因兔。用FSH+hCG对普通新西兰大白兔进行超数排卵,将其与本实验室制备出转PCL-25/rhPA的转基因公兔进行配种,通过手术法获取受精卵,通过显微注射,向受精卵中注射PCL-25/rhPA-Neo片段。将注射后的受精卵移植到同期发情的受体母兔中,来制备再转基因兔。出生30日龄的仔兔取兔耳皮肤组织,提取gDNA,以基因组DNA为模板,用Neo-s、Neo-a和CMV-tPA-s、CMV-tPA-a两对引物对提取的gDNA进行扩增,检测整合情况,将检测出整合的母兔饲养至5月龄,将其与普通公兔进行配种,产仔后,收集兔奶,通过ELISA检测,纤维蛋白平板溶圈法(FA PA)检测,测出兔奶中rhPA的表达量及活性,将其与单位点整合兔所产兔奶中rhPA的表达量及活性进行比较。小鼠血栓模型制备采用腹腔注射角叉菜胶的方法。制模试验分6个剂量组,每组3只8-10周龄ICR母鼠,分别为：3mg/只、1.5mg/只、0.3mg/只、0.15mg/只、0.03mg/只、以及生理盐水对照组,12h后测量小鼠尾部血栓形成情况,探究角叉菜胶诱导小鼠尾部血栓形成的最适浓度,动物溶栓试验分为5组,每组4只8-10周龄ICR母鼠。分别为生理盐水对照组、阿替普酶药物0.4mg/只、纯化rhPA0.1 mg/只、纯化rhPA 0.4m g/只、纯化rhPA 1.6mg/只,22h、32h、42h分别测量小鼠尾部血栓长度变化,最后处死小鼠,采血检测小鼠血浆中凝血酶原形成时间(PT)、凝血酶形成时间(TT),来分析纯化产物在小鼠体内的溶栓情况。本实验制备构建了PCL-25/rhPA-Neo显微注射基因片段,并制备了6只同时整合PCL-25/rhPA-Neo和PCL-25/rhPA的双位点整合兔(4早,2♂)；1只整合PCL-25/rhPA-Ne o的单位点整合兔(1早)；7只整合PCL-25/rhPA的单位点整合兔(4♀,3♂)。将转基因母兔与普通公兔配种,收集兔乳,分离出乳清,乳清通过ELISA检测,纤维蛋白平板溶圈法(FAPA)检测,结果表明双位点整合兔奶中rhPA表达量、溶栓活性均比单位点整合兔高。用不同浓度角叉菜胶诱导小鼠尾栓形成,结果显示,第一组到第四组(3mg/只、1.5mg/只、0.3mg/只、0.15mg/只)血栓平均相对百分比为75%左右,第五组(0.03mg/只)血栓平均相对百分比为11.6%。前四组中,尾部血栓长度差别不大,所以我们选择第四组,即0.15mg/只的角叉菜胶来制备动物血栓模型。用不同浓度纯化的rhPA对小鼠血栓模型进行治疗,结果发现治疗组均对小鼠尾部血栓有很好的治疗效果,纯化产物rhPA治疗小鼠尾血栓,在效果和剂量上均比阿替普酶药物好,且剂量为1.6mg/只小鼠时,在三次给药后能够治愈小鼠尾部血栓疾病。本实验制备出了同时整合PCL-25/rhPA-Neo和PCL-25/rhPA的双位点整合兔,并发现其表达产物rhPA的活性、表达量高于转rhPA基因的单基因兔。通过小鼠溶栓试验发现,纯化产物rhPA治疗小鼠尾部血栓的效果比阿替普酶药物好。在兔的乳腺中表达重组人组织纤溶酶原激活剂,以及rhPA的动物溶栓试验在国内外都未见报道。