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目的:观察改变NDUFA4表达对人结直肠癌(colorectal carcimona,CRC)细胞生长的影响;探讨NDUFA4对人CRC细胞生长影响可能的分子机制;检测NDUFA4在人CRC临床组织中的表达并分析其临床意义。方法:1.利用Real time PCR和Western Blot检测不同人结直肠癌细胞株中NDUFA4的表达情况;免疫荧光法验证人结直肠癌细胞株SW620细胞和SW480细胞中NDUFA4的表达;设置p-NDUFA4组、p-Cont组和sh-NDUFA4组、sh-NC组,利用Lipofectamine 3000转染试剂,将前期构建的NDUFA4过表达质粒(p-NDUFA4)、对照质粒(p-Cont)和NDUFA4干扰质粒(p-shNDUFA4)、对照质粒(p-shCont)分别体外瞬时转染人CRC直肠癌SW620细胞和SW480细胞;Real time PCR和Western Blot检测转染后各组细胞中NDUFA4的表达情况;CCK-8法和克隆形成实验检测各组细胞增殖活性和克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期的变化;Western Blot检测细胞周期相关蛋白及AKT、ERK1/2等信号通路的改变;免疫荧光技术检测增殖核抗原(Ki-67)的表达;TUNEL染色检查细胞凋亡情况;免疫荧光技术检测线粒体膜电位JC-1的变化以及线粒体活性氧ROS的表达;比色法和化学发光法分别检测各组细胞能量变化相关NAD/NADH的比率及ATP水平变化。2.用Lipofectamine 3000转染试剂把p-NDUFA4过表达质粒和p-Cont对照载体,分别体外瞬时转入人结直肠癌SW620细胞;利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)及质谱(Mass Spectroscope,MS)方法筛选NDUFA4的靶分子;通过Western Blot和免疫荧光共聚焦分别检测靶分子在各组细胞中的表达及与NDUFA4共定位情况;Co-IP反相验证靶分子与NDUFA4结合情况;将靶分子RNAi干扰序列和p-NDUFA4分别共转染人结直肠癌SW620细胞和SW480细胞;Real time PCR和Western Blot检测各组细胞中NDUFA4和靶分子表达情况;并用CCK8法和克隆形成实验分别检测细胞增殖活性和克隆形成能力;化学发光法检测ATP的表达情况;Western Blot检测细胞周期相关蛋白和AKT,ERK1/2信号通路的改变。3.通过免疫组化的方法检测180例人CRC临床患者肿瘤标本中NDUFA4表达情况;根据NDUFA4表达量进行免疫组织化学评分,将患者分为高表达组和低表达组,并对两组患者的年龄、性别、组织学分级、TNM分期、肿瘤大小、NDUFA4的表达、临床分期等进行分析;通过Kaplan-Meier法计算出两组患者的总生存期;进一步利用免疫组化的方法,检测靶分子在临床结直肠癌患者标本中的表达情况;Pearson法分析LRPPRC与NDUFA4之间的临床相关性。结果:1.Real time PCR和Western Blot结果显示:与FHC细胞相比,NDUFA4在不同人CRC细胞株中均显著上调,其中SW480表达量最高(P<0.05);免疫荧光结果显示:NDUFA4在SW480细胞中的表达明显高于SW620细胞(P<0.05);Real time PCR和Western Blot结果显示:与p-Cont对照组相比,p-NDUFA4组SW620细胞细胞中NDUFA4表达水平显著升高(P<0.05),与sh-NC组相比,sh-NDUFA4组SW480细胞中NDUFA4表达水平显著降低(P<0.05);CCK-8法和克隆形成实验结果显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4组SW620细胞增殖和克隆形成能力显著增强(P<0.05);相反,与sh-NC组相比,sh-NDUFA4组SW480细胞增殖和克隆形成明显减弱(P<0.05);细胞周期结果进一步显示:p-NDUFA4组SW620细胞G0/G1期比例下调(P<0.05),S期比例上调(P<0.05),G2/M期比例下调(P<0.05),而sh-NDUFA4组SW480细胞G2/M期比例下调(P<0.05),S期比例下调(P<0.05),G0/G1期比例上调(P<0.05);Western Blot结果显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4组SW620细胞中生长相关蛋白CDK4,CDK2,CyclinD1,CyclinE1,CyclinA2,p-RB表达显著上调(P<0.05),p-AKT,p-ERK1/2,c-Myc表达上调(P<0.05),AKT,ERK1/2表达无明显差异(P>0.05);而p53和p-p53相比于p-Cont组显著下调(P<0.05);同时,与sh-NC对照组相比,sh-NDUFA4组SW480细胞中生长相关蛋白CDK4,CDK2,CyclinD1,CyclinE1,CyclinA2,p-RB表达显著下调(P<0.05),而p-AKT,p-ERK1/2,c-Myc表达下调(P<0.05),AKT,ERK1/2表达无明显差异(P>0.05),而p53和p-p53相比于sh-NC组显著上调(P<0.05);免疫荧光共聚焦结果显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4组SW620细胞Ki-67表达显著增加(P<0.05),而细胞凋亡明显减少(P<0.05),JC-1红色荧光明显增加,线粒体活性氧ROS产生明显的减少;与sh-NC对照组相比,sh-NDUFA4组SW480细胞则Ki-67表达显著下调(P<0.05),细胞凋亡的程度显著增加(P<0.05),JC-1绿色荧光增多,线粒体活性氧ROS产生显著增加;比色法结果显示:与p-Cont组相比,p-NDUFA4组SW620细胞NAD/NADH比值降低(P<0.05),而与sh-NC对照组相比,sh-NDUFA4组SW480细胞NAD/NADH比值升高(P<0.05);化学发光法结果显示:p-NDUFA4组相比,p-NDUFA4组SW620细胞ATP表达显著增加(P<0.05),而与sh-NC对照组相比,sh-NDUFA4组SW480细胞ATP表达显著降低(P<0.05)。2.免疫共沉淀及质谱方法结果显示:筛选的富含亮氨酸的PPR基序蛋白(Leucine-rich PPR motif-containing protein,mitochondrial,LRPPRC)可能为NDUFA4相互作用的潜在靶分子;Western Blot结果显示:LRPPRC存在于SW620细胞中;免疫荧光共聚焦结果显示:LRPPRC与NDUFA4共定位于SW620和SW480细胞线粒体;CO-IP实验进一步发现,NDUFA4能够与LRPPRC相互结合;Real time PCR和Western Blot结果显示:与p-NDUFA4对照组相比,p-NDUFA4-si-LRPPRC组细胞中LRPPRC表达明显下调(P<0.05);CCK-8法和克隆形成实验结果显示:与p-NDUFA4组相比,p-NDUFA4-si-LRPPRC组SW620和SW480细胞增殖和克隆形成能力显著减弱(P<0.05);化学发光法结果显示:与p-NDUFA4组相比,p-NDUFA4-si-LRPPRC组SW620和SW480细胞ATP表达显著降低(P<0.05);Western Blot结果显示:与p-NDUFA4组相比,p-NDUFA4-si-LRPPRC组SW620和SW480细胞中生长相关蛋白CDK4,CDK2,CyclinD1,CyclinE1,CyclinA2,p-RB表达显著下调(P<0.05),p-AKT,p-ERK1/2,c-Myc表达下调(P<0.05),AKT,ERK1/2表达无明显差异(P>0.05);而p53和p-p53相比于p-NDUFA4-si-LRPPRC组显著上调(P<0.05)。3.组织芯片结果显示:与正常组织相比,NDUFA4在180例CRC癌组织高表达(P<0.05);将病人分为NDUFA4高表达组和NDUFA4低表达组,Cox回归分析法表明,组织学分级、临床分期是影响患者生存的独立危险因素(P<0.05);Kaplan-Meier法分析发现,组间无明显统计学差异(P>0.05);组织芯片结果显示:与正常癌旁组织相比,LRPPRC在CRC癌组织中高表达(P<0.01);Pearson分析显示:结直肠癌中NDUFA4与LRPPRC的表达呈正相关(P<0.05)。结论:1.NDUFA4过表达促进人结直肠癌细胞体外生长和线粒体能量代谢,而下调NDUFA4表达抑制人结直肠癌细胞体外生长和线粒体能量代谢。2.LRPPRC为NDUFA4相互作用的靶分子,下调LRPPRC表达能逆转NDUFA4过表达对人结直肠癌细胞生长的促进作用。3.NDUFA4在人结直肠癌标本中高表达,其高表达与LRPPRC表达呈正相关。