增生性瘢痕是机体组织受到创伤后异常修复的结果,是创伤修复过程中的一种必然产物。增生性瘢痕严重影响患者的生活质量,给患者带来疼痛、瘙痒等不良症状,严重可能带来功能障碍等。从生物学的角度来看,瘢痕的形成是由于胶原代谢紊乱形成的。瘢痕组织是由于细胞外基质过度沉积产生的,基质的主要成分包括胶原纤维、结构蛋白和蛋白多糖等,其中Ⅰ型胶原纤维占的比重较大。瘢痕的形成与胶原的合成与降解紧密相关,胶原的合成和降解失衡,会引起胶原纤维的代谢减少,进而形成瘢痕组织。研究显示,瘢痕的形成与多种细胞因子的异常表达紧密相关,转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在这一过程中扮演着重要的角色。TGF-β一方面对血管生成和成纤维细胞的增殖具有促进作用,可以促进成纤维细胞合成胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白;另一方面TGF-β对基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase-1,MMP1)的表达和活性具有一定的抑制作用,并且促进金属蛋白酶组织抑制剂-1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP1)的表达,从而抑制胶原等细胞外基质的降解,因此,TGF-β被认为是影响创面愈合和瘢痕生长的重要因子之一。创面愈合和瘢痕形成的机制及治疗方法已经成为当下的研究热点,广泛受到分子生物学、生物物理学、生物医学工程、组织工程学和临床医学等学科的关注,越来越受到人们的重视。目前采取的治疗方法主要分为手术治疗和非手术治疗。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的主要作用机制是干扰成纤维细胞DNA的复制和转录,进而抑制成纤维细胞的增殖和蛋白的过度表达,从而减轻瘢痕增生和胶原沉积。换言之,当5-FU进入瘢痕组织才能很好的发挥药效。我们前期的研究表明,驻极体是一种安全有效的物理促渗手段,可以促进药物透过皮肤致密的角质层结构,进入皮肤内部发挥药效。在众多瘢痕治疗方法中,物理疗法是目前比较常用的方法,其中电场(压)用于创面愈合和瘢痕治疗表现出巨大的潜力。将电刺激疗法用于创面愈合于2002在美国获得承认。驻极体是一类功能电介质材料,能够长期保持极化电荷和储存空间电荷。驻极体可以产生持续稳定的静电场和微电流,静电场和微电流作用于具有生物驻极态的组织和分子时,能起到良好的生物效应和促进组织康复的作用。在临床用药中,用于治疗增生性瘢痕的剂型以传统剂型为主,主要有注射剂、膏剂和霜剂等。但是传统剂型都有各自的局限性,因此本文选用透皮给药剂型,并选用对增生性瘢痕有确切效果的抗肿瘤药物5-FU为模型药物,联合驻极体研究其对增生性瘢痕的作用及机制。本文的主要内容包括:(一)5-FU贴剂的制备、处方优化及性质表征本文以5-FU为模型药物,Eudragit E100为基质,柠檬酸三丁酯为增塑剂,采用溶剂挥发法制备压敏胶贴剂。在贴剂的制备过程中,E100的质量、增塑剂与E100二者的比例可能影响贴剂的性质。通过单因素考察确定影响贴剂性质的变量,随后我们通过正交设计实验,以贴剂的初黏力、持黏力及自然释放度为考察指标,采用综合评分法对贴剂的处方进行优化,确定优化处方,并对贴剂进行性质表征。结果显示:E100质量、柠檬酸三丁酯与E100质量比对贴剂的性质均有影响,通过综合评分法确定在E100质量为0.30g,柠檬酸三丁酯比例55%的条件,5-FU贴剂的处方最优。并对上述方法制备的贴剂进行了表征,得到贴剂的性质如下:初黏力为(4.03±0.53)g,持黏力为(122.50±7.13)min。随后对贴剂的自然释放度进行了考量,并考察了不同极性、不同表面电位驻极体对贴剂自然释放度的影响,并对5-FU贴剂的自然释放进行了数学建模。结果显示:(1)5-FU贴剂释放规律符合Higuchi方程;(2)驻极体作用后贴剂的释放量有所增加,释药量随着驻极体表面电位的增大而增加,正、负极性驻极体组之间无显著性差异,释放规律同样满足Higuchi方程;(3)驻极体5-FU贴剂的释放规律满足如下方程:（？）注:Q为累计释放量,V为驻极体表面电位,t为时间(二)5-氟尿嘧啶贴剂动物实验给药方案的探究驻极体具有改善局部血液微循环的作用,可以改善上皮细胞的生长环境;另外驻极体产生的微电流可以刺激上皮细胞分化。而5-FU具有抑制细胞DNA和RNA复制的作用,抑制细胞的增殖。因此我们需要探索出适当的驻极体5-FU贴剂的给药方式。通过测定创面愈合率、创面皮肤厚度变化及HE染色法观察创面组织形态学改变,探究新的给药方案。结果显示:(1)驻极体可以促进创面的收缩,作用大小与驻极体表面电位显示出正相关,正负极性驻极体组之间无显著性差异;(2)5-FU贴剂组大鼠皮肤创面愈合缓慢,显示出5-FU对创面愈合具有抑制作用;(3)HE染色法观察创面皮肤组织形态学的改变,结果显示出与创面愈合率、创面皮肤厚度相同的结论。因此,确定了最终的给药方案,即创面形成0-14天,对患处施加驻极体;14-42天,在患处加以驻极体5-FU贴剂,进行后续研究。(三)通过动物学实验研究驻极体5-FU贴剂对大鼠皮肤增生性瘢痕生长的抑制作用在确定了5-FU贴剂的制备方法、以及给药方案后,进行了5-FU贴剂抑制瘢痕生长的动物学研究。分别于给药后1周、2周、3周、4周取样,测定瘢痕增生指数,并通过HE染色及免疫组化法考察5-FU贴剂对大鼠皮肤增生性瘢痕的抑制作用。瘢痕增生指数结果显示:(1)对照组大鼠瘢痕增生指数逐渐升高;(2)驻极体组大鼠皮肤瘢痕增生指数有降低的趋势;(3)5-FU贴剂组及驻极体5-FU贴剂组瘢痕增生指数降低,驻极体5-FU贴剂组效果更佳。HE染色结果显示:(1)对照组大鼠皮肤瘢痕组织持续增生,主要表现为表皮和真皮层增生。真皮层可见大量成纤维细胞,胶原纤维沉积明显、粗大、致密,排列无序。(2)5-FU贴剂组与对照组相比,大鼠瘢痕组织表皮层、真皮层均明显变薄,真皮层成纤维细胞量变少,胶原沉积现象得到明显缓解,抑制瘢痕增生作用效果显著;(3)不同极性、不同表面电位驻极体5-FU贴剂组与5-FU贴剂组相比,这一效果更加显著,随着驻极体表面电位的增加,抑制瘢痕增生的效果更显著,正、负极性驻极体组之间的差异并不显著。免疫组化结果显示:(1)5-FU贴剂组及驻极体5-FU贴剂组大鼠皮肤瘢痕组织中TGF-β表达量下降,Smad2、Smad3的表达量下降,Smad7的表达量有所上升,ColⅠ、ColⅢ的表达量下降;(2)驻极体5-FU贴剂组这一效果更加显著;(3)5-FU贴剂组及驻极体5-FU贴剂组大鼠皮肤瘢痕组织中TGF-β表达量下降,MMP1的表达量有所上升,MMP2、TIMP1、ColⅠ、ColⅢ的表达量下降,驻极体5-FU贴剂组作用更加明显;(4)驻极体5-FU贴剂对增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。(四)通过细胞学实验研究驻极体5-FU贴剂对大鼠皮肤增生性瘢痕生长的抑制作用动物学实验证明驻极体5-FU贴剂对增生性瘢痕生长的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。为了进一步探究和验证驻极体5-FU贴剂抑制瘢痕生长的机制。我们进行了细胞学实验,分别通过MTT法、PCR法和Western-Blot法进行考察。MTT实验结果显示:(1)驻极体可以促进细胞的增殖;(2)5-FU对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用。PCR实验结果显示:(1)5-FU给药组及驻极体5-FU给药组TGF-β表达量下降,Smad2、Smad3的mRNA表达量下降,Smad7的mRNA表达量有所上升,ColⅠ、ColⅢ的表达量下降;(2)驻极体5-FU组这一效果更佳显著;(3)5-FU给药组及驻极体5-FU给药组MMP1的mRNA表达量有所上升,MMP2、TIMP1、ColⅠ、ColⅢ的表达量下降,驻极体5-FU组作用更加明显;(4)驻极体5-FU对增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。Western-Blot实验结果显示:(1)给药组TGF-β蛋白表达量下降,Smad2、Smad3的蛋白表达量下降,Smad7的表达量有所上升,ColⅠ、ColⅢ的表达量下降;(2)驻极体5-FU组这一效果更佳显著;(3)给药组MMP1的蛋白表达量有所上升,MMP2、TIMP1、ColⅠ、ColⅢ的表达量下降,驻极体5-FU组作用更加明显;(4)驻极体5-FU对增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路有显著影响。上述实验结果与动物学实验结果相一致,表明驻极体5-FU贴剂可以通过抑制增生性瘢痕形成的TGF-β/Smads、TGF-β/MMPs信号通路抑制瘢痕的生长。综上所述,本文通过动物学实验和细胞学实验对驻极体5-FU贴剂抑制增生性瘢痕生长的机制进行了探究,探索治疗增生性瘢痕的新方法与新途径。