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目的微环境(niche)所提供的趋化因子调节成体干细胞的许多重要的生物学功能。目前,趋化因子是否影响人多潜能干细胞(human pluripotent stem cells,h PSCs)的生物学功能尚不清楚。本研究首先建立人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,h ESCs)株和人诱导多功能干细胞(human-induced pluripotent stem cells,hi PSCs)株,并进一步鉴定这些细胞的全能性;其次,分析KSR和m Te SR1培养体系分别对h ESCs和hi PSCs体外培养的多能性维持的影响;再次,针对不同的培养条件(KSR和m Te SR1),通过蛋白芯片技术对h PSCs(h ESCs和hi PSCs)培养上清中的趋化因子进行高通量筛选,并分析这些趋化因子的来源;最后,研究上清中高表达的趋化因子对h PSCs体外的迁移、多能性维持的调节作用,最终发现对h PSCs具有重要调节作用的关键趋化因子。方法1)利用免疫外科法建立人ES细胞系,并通过核型鉴定、碱性磷酸酶(AP)染色、免疫荧光、real-time PCR等技术对所建立的ES细胞系的多能性进行鉴定;同时,通过拟胚体分化、畸胎瘤实验验证ES细胞体外、体内的分化潜能。2)通过逆转录病毒系统将四种转录因子Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc导入体细胞HFFs中,诱导HFFs重编程,从而建立人i PS细胞系,并通过免疫荧光技术对其多能性进行初步鉴定。3)通过AP染色、免疫荧光技术分别分析KSR和m Te SR1两种培养体系对人ES和i PS细胞的多能性维持的影响。4)利用蛋白芯片技术分别对人ES和i PS细胞在两种培养体系上清中的趋化因子进行高通量筛选,并进一步分析h PSCs上清中趋化因子的来源。5)利用外源性人重组IL-8、IP-10和SDF-1a蛋白进行细胞迁移诱导实验,分析这些趋化因子及受体信号对h PSCs体外迁移的影响;同时,采用对应受体特异的抑制剂reparixin/SB265610、NBI74330和AMD3100验证这些趋化因子信号通路在h PSCs的迁移功能。6)通过real-time PCR检测趋化因子蛋白及受体特异的抑制剂处理的h PSCs的多能性基因(Oct4、Nanog和Rex-1)及分化基因(AFP、c-actin和Sox1)的m RNA表达水平的改变,分析IL-8-CXCR1/2、IP-10-CXCR3和SDF-1a-CXCR4信号通路在h PSCs体外维持培养中的作用。结果1)成功建立人ES细胞株。首先,这些ES细胞能够自我更新、不断增殖、具备正常的染色体核型,并且表达较高的碱性磷酸酶活性;其次,这些细胞高表达多能性基因(Oct4、Nanog及Rex-1)和多能性标志物(Oct4、Nanog、TRA-1-81及TRA-1-60);再次,这些细胞能够形成EBs并进一步分化为类三胚层细胞,这些最终分化的细胞高表达三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)基因和标志物,即ES细胞具有体外的分化潜能(或多能性);最后,这些细胞被移植到NOD SCID小鼠后腿肌肉中能够形成畸胎瘤,进一步的免疫组化HE染色结果表明ES细胞能够在体内分化为正常、完整的三个胚层组织。这些结果表明所建立的ES细胞具有全能性,即我们成功获得人ES细胞系。2)成功建立人i PS细胞系。与人ES细胞类似,i PS细胞具有自我更新和不断增殖的特性,并且高表达Oct4/Nanog/TRA-1-81/TRA-1-60,即i PS细胞具有多能性。3)在KSR和m Te SR1培养体系中,h ESCs和hi PSCs均具有较高的AP活性和高表达四种多能性标志物,这些结果表明h PSCs在两种培养体系中均能够维持其多能性。4)38种趋化因子蛋白芯片的相对信号强度(RSI)表明,h ESCs-m Te SR1与h ESCs+Feeder cells-KSR上清中含有更多种类和更高浓度的趋化因子,即来自干细胞和饲养层细胞的分泌物是h PSCs培养上清中主要的趋化因子组分。5)外源性的重组IL-8、IP-10和SDF-1a蛋白均能够诱导h PSCs的迁移,并且这种迁移作用能够被受体特异的抑制剂reparixin/SB265610、NBI74330或AMD3100所阻断,结果表明这些趋化因子及其受体信号通路介导h PSCs的体外迁移。6)外源性的IL-8显著地减少h PSCs的多能性基因(Oct4、Nanog及Rex-1)m RNA表达和显著地增加分化基因(AFP、c-actin及Sox1)的m RNA表达;然而,受体抑制剂reparixin/SB265610阻断信号后,三个多能性基因的表达显著地被上调和三个分化基因的表达显著地被下调。然而,IP-10和SDF-1a的情况则完全相反。这些结果表明IL-8-CXCR1/2信号通路趋向于加强h PSCs的分化作用,而IP-10-CXCR3和SDF-1a-CXCR4信号则趋向于加强h PSCs的多能性。结论综上研究结果表明,h PSCs培养上清中的趋化因子主要有三个来源:干细胞自身、饲养层细胞以及培养基。其中,三个重要的趋化因子(IL-8、IP-10和SDF-1α)及受体信号通路调节h PSCs的体外迁移和多能性的维持。此外,趋化因子介导了h PSCs的分化及多能性(或去分化)两种状态。在体外,平衡的趋化因子趋向于加强h PSCs的多能性。