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研究背景：
心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/RI)是导致缺血性心脏病临床治疗效果不理想的最主要原因之一，常常给患者造成严重并发症、预后不良，甚至死亡等不良事件的发生。因此，积极寻找抗MI/RI的药物及探寻其发生的机制也就成为当前研究的热点。褪黑素(melatonin, Mel)是一种由松果体合成分泌的吲哚类神经内分泌激素，广泛存在于诸如心脑血管、淋巴、胸腺、胃肠道和皮肤等多种细胞和器官中，它对人体的免疫、生殖、内分泌、心血管和中枢神经等系统都有显著的调节作用。近年来，对褪黑素在抗氧化应激、抗炎和在高血压、心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病中保护作用的研究证实，褪黑素与心血管疾病的发生发展有着密切的关系。
室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是调节交感神经活动和缺血性心脏病的中枢部位；而交感神经兴奋性增强可缩短心室不应期，引起外周血管和冠状动脉收缩，从而导致缺血性心脏病的发生。褪黑素可穿过血脑屏障进入中枢抑制交感神经兴奋性，并通过激活沉默信息调节因子1(SIRT1)，进而抑制NF-κB，最终通过抑制氧化应激和炎性反应来达到心肌保护作用，且此作用是受体依赖性的；褪黑素受体广泛分布于室旁核中。然而，在室旁核中的褪黑素对MI/RI的心肌保护作用尚未引起重视。因此我们推测褪黑素在中枢可能通过调节SIRT1和NF-κB通路，进一步影响室旁核氧化应激和炎性反应，最终降低了外周交感神经活动而达到了心肌保护作用。本课题从室旁核SIRT1/NF-κB信号通路在褪黑素心肌保护中的作用为出发点，探讨褪黑素抗MI/RI的发生发展机制。这将为全面解释褪黑素的心肌保护作用和在临床中的应用提供科学理论依据，并补充新的观点。
研究目的：
1.研究下丘脑室旁核中ROS，NE，NAD(P)H亚单位NOX2，NF-κB，IL-1β，IL-10和SIRT1在大鼠MI/RI模型中是否被大量激活，并通过增强外周交感神经活动加重心肌缺血再灌注损伤。进一步证实给予褪黑素是否改善心肌缺血再灌注损伤和心功能。
2.通过给予输注SIRT1及其阻断剂EX527，研究证实室旁核中褪黑素是否通过调节SIRT1的表达，进一步调节氧化相关因子NOX2、NF-κB和炎症相关因子IL-1β、IL-10的表达来改善心肌缺血再灌注损伤。
3.研究褪黑素通过调节SIRT1信号通道的心脏保护作用是否被褪黑素受体阻滞剂(luzindole)所抑制，从而证实室旁核中褪黑素的心脏保护作用是否通过其膜受体来实现的。
研究方法：
本实验采用SD大鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，分别通过腹腔注射褪黑素和双侧室旁核微量泵慢性输注褪黑素两种给药方式，并通过超声心动图检查(HR、LVEF、LVFS、LVEDV)，DHE染色(ROS)，Evansblue-TTC染色(心梗面积)，免疫荧光、免疫组化和Westernblot(NOX2、IL-1β，IL-10、SIRT1)，以及ELISA(NE、NF-κB)等实验方法，观察心肌缺血再灌注损伤时室旁核中SOD、NE、NOX2、IL-1β，IL-10、NF-κB和SIRT1的变化，以及心功能的变化。
1.经腹腔注射褪黑素(10mg/(kg·d))预处理2周后建立心肌缺血再灌注损伤模型，经历缺血30min，再灌注6小时后行Evansblue-TTC染色，之后处死并留取标本。通过DHE染色、免疫荧光、免疫组化、Westernblot以及ELISA等实验方法，观察外周给予褪黑素后心肌缺血再灌注损伤模型的SOD、NE、NOX2、IL-1β，IL-10、NF-κB和SIRT1的变化；另一批模型在缺血30min、再灌注1周后行超声心动图检查，评估心脏功能变化。
2.经双侧室旁核慢性泵入褪黑素(0.025?g/h)预处理2周后建立心肌缺血再灌注损伤模型，经历缺血30min，再灌注6小时后行Evansblue-TTC染色，之后处死并留取标本。通过DHE染色、免疫荧光、免疫组化、Westernblot以及ELISA等实验方法，观察室旁核给予褪黑素后心肌缺血再灌注损伤模型的SOD、NE、NOX2、IL-1β，IL-10、NF-κB和SIRT1的变化；另一批模型在缺血30min、再灌注1周后行超声心动图检查，评估心脏功能变化。
3.经双侧室旁核慢性泵入褪黑素及其膜受体阻滞剂luzindole，和SIRT1及其阻断剂EX527；预处理2周后建立心肌缺血再灌注损伤模型，经历缺血30min，再灌注6小时后通过免疫荧光、Westernblot以及ELISA等实验方法，观察室旁核给予褪黑素后心肌缺血再灌注损伤模型的SIRT1、NF-κB、IL-1β，IL-10和NE的变化；另一批模型在缺血30min、再灌注1周后行超声心动图检查，评估心脏功能变化。探索褪黑素的心肌保护作用，以及它是否通过调节室旁核SIRT1途径和NE的表达来抗心肌缺血再灌注损伤；在此基础上，进一步证实褪黑素的抗MI/RI作用是依赖于褪黑素膜受体的。
研究结果：
1.心肌缺血再灌注损伤可以引起室旁核氧化应激和炎性反应，导致下丘脑室旁核ROS、NAD(P)H亚单位NOX2和NF-κB、促炎因子IL-1β以及NE被大量激活，抗炎因子IL-10及抗氧化蛋白Cu/Zn-SOD被抑制，SIRT1表达下降，并降低了心脏功能。
2.在大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型中，外周经腹腔注射褪黑素和室旁核慢性泵入褪黑素预处理后，均出现下丘脑室旁核SIRT1蛋白表达升高，NOX2表达下降，NF-κB、IL-1β和NE表达下降，抗炎因子IL-10及抗氧化蛋白Cu/Zn-SOD蛋白表达显著升高；外周交感神经活动受抑制，缓解了心肌缺血再灌注损伤并改善了心功能。
3.在室旁核慢性泵入褪黑素预处理后的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，给予SIRT1阻断剂EX527后，NF-κB活性增强，IL-1β和NE表达水平升高，抗炎因子IL-10表达下降；从而减弱了室旁核给予褪黑素的心肌保护效应。
4.在室旁核慢性泵入褪黑素预处理后的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，给予褪黑素膜受体阻滞剂luzindole后，室旁核SIRT1蛋白表达降低，NOX2表达升高，NF-κB活性增强，IL-1β和NE表达水平升高，IL-10和Cu/Zn-SOD蛋白表达水平下降；显著减弱了室旁核给予褪黑素的心肌保护效应。
研究结论：
在大鼠MI/RI的动物模型中，室旁核中的氧化应激和炎性反应相关指标显著增强，分别经腹腔注射或经双侧室旁核慢性给予褪黑素均可产生心肌保护作用，此作用可被SIRT1阻断剂EX527和褪黑素受体阻滞剂luzindole减弱。其机制可能是室旁核输注褪黑素后激活了室旁核SIRT1信号通路，从而抑制了室旁核氧化应激和炎性反应，抑制了NF-κB激活，降低了炎性细胞因子的表达，降低了外周交感神经活动，并改善了心脏功能，最终达到了心肌保护作用；并且褪黑素的这种心肌保护作用是依赖于褪黑素受体的。
心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury, MI/RI)是导致缺血性心脏病临床治疗效果不理想的最主要原因之一，常常给患者造成严重并发症、预后不良，甚至死亡等不良事件的发生。因此，积极寻找抗MI/RI的药物及探寻其发生的机制也就成为当前研究的热点。褪黑素(melatonin, Mel)是一种由松果体合成分泌的吲哚类神经内分泌激素，广泛存在于诸如心脑血管、淋巴、胸腺、胃肠道和皮肤等多种细胞和器官中，它对人体的免疫、生殖、内分泌、心血管和中枢神经等系统都有显著的调节作用。近年来，对褪黑素在抗氧化应激、抗炎和在高血压、心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病中保护作用的研究证实，褪黑素与心血管疾病的发生发展有着密切的关系。
室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是调节交感神经活动和缺血性心脏病的中枢部位；而交感神经兴奋性增强可缩短心室不应期，引起外周血管和冠状动脉收缩，从而导致缺血性心脏病的发生。褪黑素可穿过血脑屏障进入中枢抑制交感神经兴奋性，并通过激活沉默信息调节因子1(SIRT1)，进而抑制NF-κB，最终通过抑制氧化应激和炎性反应来达到心肌保护作用，且此作用是受体依赖性的；褪黑素受体广泛分布于室旁核中。然而，在室旁核中的褪黑素对MI/RI的心肌保护作用尚未引起重视。因此我们推测褪黑素在中枢可能通过调节SIRT1和NF-κB通路，进一步影响室旁核氧化应激和炎性反应，最终降低了外周交感神经活动而达到了心肌保护作用。本课题从室旁核SIRT1/NF-κB信号通路在褪黑素心肌保护中的作用为出发点，探讨褪黑素抗MI/RI的发生发展机制。这将为全面解释褪黑素的心肌保护作用和在临床中的应用提供科学理论依据，并补充新的观点。
研究目的：
1.研究下丘脑室旁核中ROS，NE，NAD(P)H亚单位NOX2，NF-κB，IL-1β，IL-10和SIRT1在大鼠MI/RI模型中是否被大量激活，并通过增强外周交感神经活动加重心肌缺血再灌注损伤。进一步证实给予褪黑素是否改善心肌缺血再灌注损伤和心功能。
2.通过给予输注SIRT1及其阻断剂EX527，研究证实室旁核中褪黑素是否通过调节SIRT1的表达，进一步调节氧化相关因子NOX2、NF-κB和炎症相关因子IL-1β、IL-10的表达来改善心肌缺血再灌注损伤。
3.研究褪黑素通过调节SIRT1信号通道的心脏保护作用是否被褪黑素受体阻滞剂(luzindole)所抑制，从而证实室旁核中褪黑素的心脏保护作用是否通过其膜受体来实现的。
研究方法：
本实验采用SD大鼠建立心肌缺血再灌注损伤模型，分别通过腹腔注射褪黑素和双侧室旁核微量泵慢性输注褪黑素两种给药方式，并通过超声心动图检查(HR、LVEF、LVFS、LVEDV)，DHE染色(ROS)，Evansblue-TTC染色(心梗面积)，免疫荧光、免疫组化和Westernblot(NOX2、IL-1β，IL-10、SIRT1)，以及ELISA(NE、NF-κB)等实验方法，观察心肌缺血再灌注损伤时室旁核中SOD、NE、NOX2、IL-1β，IL-10、NF-κB和SIRT1的变化，以及心功能的变化。
1.经腹腔注射褪黑素(10mg/(kg·d))预处理2周后建立心肌缺血再灌注损伤模型，经历缺血30min，再灌注6小时后行Evansblue-TTC染色，之后处死并留取标本。通过DHE染色、免疫荧光、免疫组化、Westernblot以及ELISA等实验方法，观察外周给予褪黑素后心肌缺血再灌注损伤模型的SOD、NE、NOX2、IL-1β，IL-10、NF-κB和SIRT1的变化；另一批模型在缺血30min、再灌注1周后行超声心动图检查，评估心脏功能变化。
2.经双侧室旁核慢性泵入褪黑素(0.025?g/h)预处理2周后建立心肌缺血再灌注损伤模型，经历缺血30min，再灌注6小时后行Evansblue-TTC染色，之后处死并留取标本。通过DHE染色、免疫荧光、免疫组化、Westernblot以及ELISA等实验方法，观察室旁核给予褪黑素后心肌缺血再灌注损伤模型的SOD、NE、NOX2、IL-1β，IL-10、NF-κB和SIRT1的变化；另一批模型在缺血30min、再灌注1周后行超声心动图检查，评估心脏功能变化。
3.经双侧室旁核慢性泵入褪黑素及其膜受体阻滞剂luzindole，和SIRT1及其阻断剂EX527；预处理2周后建立心肌缺血再灌注损伤模型，经历缺血30min，再灌注6小时后通过免疫荧光、Westernblot以及ELISA等实验方法，观察室旁核给予褪黑素后心肌缺血再灌注损伤模型的SIRT1、NF-κB、IL-1β，IL-10和NE的变化；另一批模型在缺血30min、再灌注1周后行超声心动图检查，评估心脏功能变化。探索褪黑素的心肌保护作用，以及它是否通过调节室旁核SIRT1途径和NE的表达来抗心肌缺血再灌注损伤；在此基础上，进一步证实褪黑素的抗MI/RI作用是依赖于褪黑素膜受体的。
研究结果：
1.心肌缺血再灌注损伤可以引起室旁核氧化应激和炎性反应，导致下丘脑室旁核ROS、NAD(P)H亚单位NOX2和NF-κB、促炎因子IL-1β以及NE被大量激活，抗炎因子IL-10及抗氧化蛋白Cu/Zn-SOD被抑制，SIRT1表达下降，并降低了心脏功能。
2.在大鼠的心肌缺血再灌注损伤模型中，外周经腹腔注射褪黑素和室旁核慢性泵入褪黑素预处理后，均出现下丘脑室旁核SIRT1蛋白表达升高，NOX2表达下降，NF-κB、IL-1β和NE表达下降，抗炎因子IL-10及抗氧化蛋白Cu/Zn-SOD蛋白表达显著升高；外周交感神经活动受抑制，缓解了心肌缺血再灌注损伤并改善了心功能。
3.在室旁核慢性泵入褪黑素预处理后的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，给予SIRT1阻断剂EX527后，NF-κB活性增强，IL-1β和NE表达水平升高，抗炎因子IL-10表达下降；从而减弱了室旁核给予褪黑素的心肌保护效应。
4.在室旁核慢性泵入褪黑素预处理后的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型中，给予褪黑素膜受体阻滞剂luzindole后，室旁核SIRT1蛋白表达降低，NOX2表达升高，NF-κB活性增强，IL-1β和NE表达水平升高，IL-10和Cu/Zn-SOD蛋白表达水平下降；显著减弱了室旁核给予褪黑素的心肌保护效应。
研究结论：
在大鼠MI/RI的动物模型中，室旁核中的氧化应激和炎性反应相关指标显著增强，分别经腹腔注射或经双侧室旁核慢性给予褪黑素均可产生心肌保护作用，此作用可被SIRT1阻断剂EX527和褪黑素受体阻滞剂luzindole减弱。其机制可能是室旁核输注褪黑素后激活了室旁核SIRT1信号通路，从而抑制了室旁核氧化应激和炎性反应，抑制了NF-κB激活，降低了炎性细胞因子的表达，降低了外周交感神经活动，并改善了心脏功能，最终达到了心肌保护作用；并且褪黑素的这种心肌保护作用是依赖于褪黑素受体的。