目的:本研究通过对不同病情严重程度及脏腑虚损哮喘患者线粒体功能及其相关受损因素的分析,试图寻找线粒体呼吸链抑制、功能障碍的关键环节,揭示L-Arg/ADMA代谢在线粒体损伤、氧代谢异常和哮喘发病中的作用机制,从代谢相关物质寻找影响哮喘发病的物质链条,为是否可通过阻断其物质链条中的关键靶点来预防和治疗哮喘提供研究基础。方法:根据2016 GINA方案的诊断标准,选择符合诊断标准的哮喘患者共122例,对入组者进行临床资料采集,包括性别、年龄、吸烟及合并过敏性鼻炎情况、肺功能分级、脏腑虚损状况等。按病情严重程分级诊断标准分为哮喘间歇状态(1级)45例、轻度哮喘(2级)23例、中度哮喘(3级)30例、重度哮喘(4级)24例;按脏腑虚损辨证诊断标准分为肺气虚组47例、肺脾气虚组39例、肺脾肾虚组36例;正常对照组44例。分别抽取静脉血(18-20ml/例),采用高效液相联合质谱法(HPLC-MS/MS)检测左旋精氨酸(L-Arg)及不对称二甲基精氨酸(ADMA)水平;酶联免疫(ELASA)检测蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMT1)、二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH1)等精氨酸代谢相关指标;并检测一氧化氮(NO)、活性氧自由基(ROS)、硫代巴比妥酸反应产物(TBARS)、8-异前列腺素(8-iso)、过氧化脂质(LPO)、丙二醛(MDA)等氧化损伤标记物;提取哮喘患者及正常对照组的血小板及线粒体,用透射电镜观察血小板线粒体的超微结构,JC-1流式细胞法测定血小板线粒体膜电位(MMP),检测三磷酸腺苷(ATP)及细胞色素C氧化酶(COX)的活性,以此评估线粒体功能。采用SPSS20.0统计软件分析它们的差异性及相关性。对患者一般资料、线粒体功能评价指标、精氨酸及相关代谢指标进行正态性检验并描述性分析,符合正态分布者采用均数±标准差(x±s)表示,对哮喘组和正常对照组的比较采用t检验;不同病情严重程度组、不同脏腑虚损组与正常对照组比较时用单因素方差分析(one-way ANOVA)及两两比较的LSD检验。对各指标之间关系的分析采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1)本次研究共计纳入122例哮喘患者,其中男性41例,女性81例,患者年龄分布在17-65岁之间,平均年龄48.28±10.61岁;正常对照组44例,其中男性15例,女性29例,年龄分布在17-64岁之间,平均年龄49.50±10.70岁,哮喘组和正常对照组之间的性别、年龄比较无显著差异(P>0.05),具有可比性。不同病情严重程度的哮喘患者年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同脏腑虚损组的哮喘患者年龄比较,肺脾肾虚组患者偏高(P<0.05);不同病情严重程度和不同脏腑虚损组的哮喘患者的BMI、吸烟、合并过敏性鼻炎的情况比较,无统计学差异(P>0.05)。不同脏腑虚损组的哮喘患者肺功能(FEV1、FEV1/FVC、PEF)比较,差异有统计学意义(P<0.05),随脏腑虚损加重显著下降;不同脏腑虚损患者的病情严重程度分布有统计学差异(P<0.05),肺气虚患者的病情严重程度分级以间歇状态(1级)为主(65.96%),其次是轻度哮喘(2级)(25.53%);肺脾气虚组患者的病情严重程度分级以中度哮喘(3级)为主(41.03%),其次为间歇状态(1级)(30.77%);肺脾肾虚组患者病情严重程度以重度哮喘(4级)为主(52.78%),其次为中度哮喘(3级)(33.33%)。2)哮喘患者与正常组的血浆8-iso、TBARS、ROS、LPO、MDA 比较,均较正常组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。哮喘组与正常组的血小板线粒体功能比较,MMP、ATP及COX均有有统计学差异(P<0.05),较正常组降低。哮喘组与正常对照组的血浆ADMA比较无统计学差异(P>0.05);哮喘组L-Arg水平、L-Arg/ADMA 比率、DDAH1水平较正常组降低,有统计学差异(P<0.05);哮喘组与正常对照组的血浆PRMT1比较无统计学差异(P>0.05)。MMP与LPO呈负相关(r=-0.198,P<0.05),ATP 与 8-iso 水平呈负相关(r=-0.193,P<0.05),COX与8-iso水平呈负相关(r=-0.423,P<0.05),与ROS水平呈负相关(r=-0.141,P<0.05)。ATP 与 ADMA 水平呈负相关(r=-0.312,P<0.05),与 L-Arg/ADMA 比率呈正相关(r=0.236,P<0.05);COX 与 ADMA 水平呈负相关(r=-0.269,P<0.05),与 DDAH1 水平呈正相关(r=0.334,P<0.05)。8-iso、TBARS水平与ADMA水平呈正相关(P<0.05),与L-Arg/ADMA呈负相关(P<0.05),与血浆DDAH1水平呈负相关(P<0.05),与L-Arg无显著相关性(P>0.05)。NO 与 8-iso 水平呈正相关(r=0.196,P<0.05)。血浆 ADMA 水平与DDAH1呈负相关(r=-0.224,P<0.05),与L-Arg、PRMT1 无显著相关性(P>0.05)。血浆NO水平与线粒体功能指标无显著相关性(P>0.05),与L-Arg、L-Arg/ADMA 比率无相关性(P>0.05)。LPO水平与PEF呈负相关(r=-0.215,P<0.05),血浆 MDA、ROS 水平与 FEV1、FEV1/FVC、PEF 呈负相关(P<0.05)。将哮喘患者年龄、性别、BMI等一般情况以及氧化应激等指标等作为自变量(X),将FEV1%、PEF分别作为因变量(Y)进行多重线性回归分析、构建回归方程,结果显示血浆丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平及体重指数(BMI)均是影响哮喘患者 FEV1%的风险因素(Y=163.305-0.958 MDA-0.016 ROS-0.685 BMI,F=26.818,R2=0.601,P<0.001,方程结果显示拟合度较高,能够解释60.1%的FEV1%的结果);血浆丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平均是影响哮喘患者PEF 的风险因素(Y=141.854-0.563MDA-0.008ROS,F=91.435,R2=0.693,P<0.001,方程结果显示拟合度较高,能够解释69.3%的PEF的结果)。3)不同病情严重程度哮喘患者和正常组血浆8-iso比较差异有统计学意义(P<0.05),高于正常组;哮喘间歇状态(1级)及轻(2级)、中度哮喘(3级)患者分别与重度哮喘(4级)患者有统计学差异(P<0.05),重度哮喘(4级)患者最高。不同病情严重程度哮喘患者和正常组血浆TBARS的两两比较无显著统计学差异(P>0.05)。不同病情严重程度的哮喘患者和正常组血浆MDA、ROS比较差异有统计学意义(P<0.05),均明显高于正常组(P<0.05);中(3级)、重度(4级)哮喘的血浆MDA、ROS明显高于哮喘间歇状态(1级)及轻度哮喘(2级)患者(P<0.05)。不同病情严重程度的哮喘患者和正常组血浆LPO比较差异有统计学意义(P<0.05),明显高于正常组,中(3级)、重度哮喘(4级)高于哮喘间歇状态(1级)患者(P<0.05)。不同病情严重程度哮喘组患者与正常组的线粒体功能比较,MMP、ATP、COX比较有统计学差异(P<0.05),较正常组降低;哮喘各不同病情程度组之间的两两比较无明显统计学差异(P>0.05),但较正常均呈下降趋势,中度哮喘(3级)相对最低。不同病情严重程度哮喘患者和正常对照组血浆L-Arg、L-Arg/ADMA比率、DDAHI比较有统计学差异(P<0.05),较正常降低;不同病情严重程度组之间有逐渐降低的趋势。不同病情严重程度的哮喘患者和正常对照组血浆NO的比较有统计学差异(P<0.05),重度哮喘(4级)患者高于哮喘间歇状态(1级)与轻(2级)、中度(3级)者(P<0.05)。不同病情严重程度的哮喘患者和正常对照组血浆ADMA、PRMT1比较,无显著统计学差异(P>0.05)。将哮喘患者的年龄、BMI及氧化应激等血清学指标作为自变量(X)与病情严重程度分级(Y)进行Logistic回归分析,建立预测模型,结果表明,血浆丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平及年龄均是影响哮喘患者病情严重程度的风险因素(Logit P--6.861+0.118 MDA+0.003 ROS+0.044年龄,经似然比检验,χ2=43.403,P<0.001,方程模型具有统计学意义;经Hosmer-Lemeshow拟合优度检验,χ2=7.070,P>0.05)。4)不同脏腑虚损组的哮喘患者和正常组血浆8-iso、LPO比较差异有统计学意义(P<0.05),不同脏腑虚损哮喘组明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05),随脏腑虚损加重,有增高趋势。不同脏腑虚损组的哮喘患者和正常组血浆TBARS 比较差异无明显统计学意义(P>0.05)。不同脏腑虚损哮喘患者和正常组血浆MDA、ROS比较,肺脾气虚、肺脾肾虚组高于正常组,且肺脾气虚、肺脾肾虚组的ROS高于肺气虚组,有统计学差异(P<0.05),随脏腑虚损情况的加重而增高。不同脏腑虚损各哮喘组患者与正常组的线粒体功能比较,MMP、ATP、细胞色素C氧化酶活性(COX)的比较有统计学差异(P<0.05),较正常组降低;随脏腑虚损加重,细胞色素C氧化酶活性有下降趋势。不同脏腑虚损的哮喘患者和正常对照组血浆L-Arg、L-Arg/ADMA 比率、DDAH1比较有统计学差异(P<0.05),较正常降低,随脏腑虚损加重有逐渐降低的趋势。不同脏腑虚损的哮喘患者和正常对照组血浆NO的比较,有统计学差异(P<0.05),较正常明显升高;各脏腑组之间随脏腑虚损加重有逐渐升高的趋势。不同脏腑虚损的哮喘患者和正常对照组血浆ADMA、PRMT1比较,无显著统计学差异(P>0.05)。将哮喘患者的年龄、肺功能(FEV1%、PEF)及氧化应激等血清学指标作为自变量(X)与脏腑虚损状况(Y)进行Logistic 回归分析,建立预测模型,结果表明,哮喘患者的年龄及PEF均是脏腑虚损状况的风险因素(Logi P=-0.871+0.173年龄-0.167PEF,经似然比检验,χ2=102.801,P<0.001,方程具有统计学意义;Hosmer-Lemeshow拟合优度检验,χ2=6.701,P>0.05),哮喘患者的年龄和PEF可以用来预测其脏腑虚损状况的发展趋势。结论:1)证实线粒体功能障碍是导致哮喘发病的重要因素,L-Arg/ADMA比率下降是线粒体功能障碍的重要原因,发现DDAH1/L-Arg/ADMA通路异常是哮喘发病的重要环节。DDAH1的降低和L-Arg的不足引起哮喘患者机体内L-Arg/ADMA比率下降和ADMA的相对过剩,导致线粒体呼吸链抑制和功能障碍,进而线粒体氧代谢紊乱、活性氧蓄积并促进氧化损伤—-这是哮喘发病的关键环节。明确指出DDAH1和L-Arg/ADMA 比率越低,线粒体受损程度越重,活性氧蓄积越多,其变化趋势与哮喘气道炎症程度变化一致。2)提出或通过外源性补充和内源性生成来增加L-Arg水平,或通过DDAH1/ADMA途径来调控L-Arg/ADMA比率平衡来减少线粒体损伤和活性氧的蓄积,这有待进一步研究验证。3)初步推断哮喘患者线粒体损伤可能是N O S过度表达NO大量生成的原因之一。当线粒体损伤,呼吸链抑制,机体内大量活性氧蓄积,引起气道上皮氧化损伤,气道内炎症细胞聚集并被激活,释放大量炎性因子及炎性介质,在它们的诱导下,内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等的iNOS表达显著增加,进而大量而持续合成NO。但二者之间的关系需研究去证实。4)证实哮喘患者的脏腑虚损状况与临床病情进展、氧代谢及其影响因素和机体氧化损伤程度均表现出一致的变化趋势。从机体代谢角度论证了中医脏腑虚损理论对病情变化趋势判断的正确性。中医脏腑虚损辨证在某种程度上可能是机体代谢改变的外在表象,通过脏腑虚损理论对临床症状等外在表象的判断进行辨证分型对哮喘患者机体内代谢受损程度的宏观预测有一定的可行性。