第一部分白介素-33在脑出血后作用及其潜在性机制研究目的:白介素-33(IL-33)是最新识别的属于IL-1家族的细胞因子,它通过与异二聚体复合物ST2L/IL-1RAcP相结合形成异三聚体复合物发挥其生物学活性。然而,IL-33在脑出血后的作用及其与ICH诱导的炎症反应、细胞凋亡和自噬等病理性变化之间的关系尚不清楚,为此,我们建立一种实验性小鼠ICH模型来明确IL-33在ICH后的作用和探讨其潜在性机制。方法:本实验总共需要456只雄性ICR小鼠,体重范围25-30g。采用向小鼠左侧纹状体内注入IV型胶原酶的方法建立脑出血(intracerebralhemorrhage,ICH)模型。运用免疫印迹(western blot,WB)方法,检测内源性IL-33和其受体ST2L在小鼠ICH后不同时间点(1h、3h、6h、12h、24h、48h和72h)损伤侧基底节的表达变化。采用免疫荧光染色法,检测IL-33和ST2L的细胞表达类型。为研究IL-33在ICH后的作用,采用行为学试验方法如Garcia和corner turn test(CTT)转角试验评定IL-33对脑出血后神经功能损伤的作用。侧脑室注射外源性IL-33(100ng/只)研究IL-33对ICH引起的脑组织含水量的影响。另外,为研究IL-33对脑出血后细胞死亡的影响,运用碘化丙啶(propidium iodide,PI)和TUNEL染色方法分别观察小鼠脑出血中心区、连接区和周围区的细胞质膜完整性破坏和细胞凋亡。为进一步探索IL-33对ICH后的神经保护性作用机制,我们检测了ICH后24h和72h损伤区基底节组织中促炎细胞因子TNF-a和IL-1β的表达变化情况,并检测损伤区基底节中凋亡相关蛋白如Bcl-2和cleaved-caspase(CC-3)表达水平以及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ和P62的表达水平。结果:(1)实验结果显示,内源性IL-33蛋白在Sham组中表达较高,然而,IL-33在损伤后6h内表达下降,并于6h和72h达到了谷底(P<0.05)。我们也检测了IL-33的跨膜受体蛋白ST2L在ICH后的表达变化,它在损伤后6h内表达升高,并在6h和24h达到峰值,随后开始下降,但IL-33的蛋白表达于72h仍然高于Sham组。(2)脑组织免疫荧光双重标记结果显示,IL-33在ICH后主要表达于GFAP阳性星形胶质细胞和Iba-1阳性的小胶质细胞,较少表达于MAP2阳性神经元。ST2L主要共定位于GFAP阳性的星形胶质细胞和Iba-1阳性小胶质细胞的胞膜上,而与MAP2阳性神经元无共定位。(3)ICH后的24h和72h,与Sham组比较,损伤侧基底节含水量明显升高(P<0.05),而IL-33预处理明显减少了损伤侧基底节的含水量(P<0.05),但并未影响损伤侧皮质、健侧皮质、基底节以及小脑脑组织含水量的变化(P>0.05)。(4)行为学Garcia神经功能和CTT转角试验数据表明,在ICH后的24h和72h,与Sham组比较,ICH明显诱导了神经功能评分的下降(P<0.05),而IL-33预处理可改善了ICH诱导的神经功能损伤(P<0.05)。(5)与ICH组相比较,预给予IL-33明显减少损伤中心区、周围区以及中心和周围连接区的PI阳性和TUNEL阳性细胞数(P<0.05)。(6)酶联免疫吸附(ELISA)实验的结果显示,在ICH后的24h和72h,ICH明显导致了TNF-a和IL-1β表达增加(P<0.05),而预给予IL-33显著下调了TNF-a和IL-1β的表达(P<0.05)并且在ICH后的72h,与IL-33(100 ng/只)相比,预处理IL-33(300 ng/只)明显减少了TNF-a和IL-1β的表达水平(P<0.05),这表明IL-33在ICH后72h抗炎作用具有浓度依赖性。(7)免疫印迹分析结果显示,在脑出血后24h和72h,ICH明显诱导了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少和促凋亡蛋白CC-3的表达增加,而预给予IL-33可逆转上述蛋白的表达(P<0.05)。此外,IL-33的抑制剂sST2明显下调了ICH诱导的Bcl-2的表达水平和增加了CC-3的表达水平(P<0.05)。(8)免疫印迹分析结果显示,IL-33预处理抑制了ICH诱导的Beclin-1表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率的升高和P62的表达水平的下调以及Beclin-1/Bcl-2比值的升高(P<0.05)。然而,sST2(300 ng/只)促进了ICH诱导的Beclin-1表达水平上调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率和Beclin-1/Bcl-2比值的升高以及P62的表达水平的下调(P<0.05)。结论:(1)IL-33可明显减轻ICH诱导的脑水肿,减少细胞凋亡和坏死,并且改善神经功能损伤。(2)IL-33在脑出血模型中通过抗炎,抑制细胞凋亡和自噬通路发挥了神经保护性作用。第二部分白介素-33在新生期大鼠反复惊厥模型中后作用及其相关机制研究目的:IL-33是最新发现的属于IL-1家族的一个与染色质相关的细胞因子,当与它的特异性受体ST2L结合后,随后募集IL-1RacP受体形成异三聚体复合物发挥其生物学活性,并在多种疾病中发挥着关键性作用。然而,IL-33在新生期大鼠反复惊厥(recurrent neonatal seizure,RNS)模型中的作用以及其相关机制尚未见相关报道,因此,本实验的目的是探索IL-33在RNS中的作用及其潜在性机制。方法:在大鼠出生后第7天(P7),36只(sprague-dawley,SD)新生期大鼠被随机分成3组:RNS+IL-33组、RNS+PBS组和Sham组。采用新生期大鼠反复吸入三氟乙醚诱导惊厥发作,每日2次,每次间隔30分钟,连续诱导7天,在损伤前30 min给予IL-33或者PBS;对Sham组同样操作,但不吸入三氟乙醚也不给予外源性IL-33。于P14每组随机取5只,共15只,断头取鼠脑皮质和海马组织,采用免疫印迹技术检测各组大鼠大脑皮质和海马的NF-κB、Bcl-2、CC-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ和P62蛋白的表达。于P23、P28分别进行神经反射实验,如前肢悬挂实验、负向趋地实验和悬崖回避试验。于P31~P35采用水迷宫(Morris water maze,MWM))实验检测大鼠学习记忆能力。结果:(1)在皮质中,RNS诱导了IL-33和ST2L蛋白的表达明显减少,而在海马中RNS诱导了IL-33和ST2L显著增加。外源性重组的IL-33注入大鼠体内后,无论在皮质还是海马中都检测到了IL-33的表达水平升高,表明重组IL-33已经进入到损伤的脑实质。此外,重组的IL-33注入大鼠体内后,在大脑皮质中检测到ST2表达显著升高,而在海马中检测到了ST2的表达水平下降。(2)免疫荧光双重标记结果显示,RNS后,IL-33与GFAP阳性星形胶质细胞共定位并共定位于其核上;与Iba-1阳性的小胶质细胞共定位,并且主要定位于其胞质。同样,IL-33也表达于NeuN阳性神经元胞质内。另外,ST2L分别共定位于GFAP阳性的星形胶质细胞、Iba-1阳性小胶质细胞和NeuN阳性神经元胞膜上。(3)在P23和P28,与Sham组比较,RNS明显诱导了神经功能损伤,如前肢悬挂实验、负向趋地实验和悬崖回避试验以及水迷宫实验,而预给予IL-33明显改善了神经功能损伤(P<0.05)。除此之外,在P7到P13,RNS明显导致大鼠体重增加(body weight gain,BWG)下降,而预给IL-33明显促进了大鼠体重增加(P<0.05)(4)ELISA实验结果显示,在血清、大脑皮质和海马组织中,与Sham组相比较,RNS组明显诱导了两种细胞因子TNF-a和IL-1β表达(P<0.05),而IL-33处理显著下调了TNF-a和IL-1β的表达(P<0.05)。(5)在脑皮质损伤区,RNS明显增加NF-κB的表达,而在海马损伤区,RNS却减少了NF-κB的表达,然而,无论在皮质区还是在海马区,外源性IL-33均能够明显减少了NF-κB的表达(P<0.05)。(6)WB分析显示,RNS明显诱导了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达减少和促凋亡蛋白CC-3的表达增加,而IL-33处理显著逆转上述两种蛋白的表达(P<0.05)。(7)WB分析显示,RNS诱导了自噬相关蛋白Beclin-1表达水平上调和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率的升高以及减少了P62的表达,而IL-33处理可逆转上述蛋白的表达(P<0.05)。结论:IL-33在新生期大鼠反复惊厥模型中通过抑制凋亡、自噬和NF-κB介导的炎症反应发挥了神经保护性作用。第三部分白介素-33在脑外伤中的作用和潜在性机制的研究目的:IL-33是一个最新发现的属于IL-1家族的细胞因子,它既可以作为一种细胞因子也可以作为一种核因子,并且它在中枢神经系统多种疾病中扮演着关键性的作用,然而,IL-33在脑外伤(traumatic brain injury,TBI)中所起到的作用及机制还不明确,因此,本研究初步探讨IL-33在TBI中的作用和潜在性机制。方法:本实验使用ICR雄性小鼠,重量均在25-30g之间。利用改良后的自由落体打击装置建立小鼠TBI模型。运用免疫印迹和免疫荧光等实验方法,检测内源性IL-33在小鼠TBI后24h的损伤脑组织中的表达变化和神经细胞定位。为探讨外源性IL-33在TBI后的作用,于TBI损伤后给予IL-33(50 ng/只鼠)采用神经功能实验如Motor Test和Morris水迷宫试验评定TBI后动物的运动和学习记忆功能以及检测损伤侧脑组织的含水量变化;为进一步探索IL-33对TBI的神经保护机制,检测TBI后24h血清中促炎细胞因子TNF-a和IL-1β的表达变化情况。此外,小鼠给予IL-33、salubrinal(SAL)和SAL+IL-33检测损伤皮质区和海马区凋亡和自噬相关蛋白的表达水平。结果:(1)在脑外伤后的皮质区,与Sham组相比较,TBI诱导了IL-33蛋白的表达增加,而在海马区,TBI诱导了IL-33的蛋白表达减少。然而,无论在损伤的皮质和海马区,外源性IL-33、SAL或者IL-33+SAL处理后均检测到了IL-33蛋白的表达升高。另外,TBI明显诱导了ST2L蛋白的表达增加,而外源性IL-33、SAL或者IL-33+SAL引起了ST2L蛋白的表达下降。(2)免疫荧光双标结果显示,在TBI后,IL-33主要与GFAP阳性的星形胶质细胞共定位,并定位于其核内。新颖地,IL-33也表达于Olig-2阳性少突胶质细胞。(3)在TBI后24h,与Sham组相比较,TBI明显诱导了损伤侧脑组织含水量升高(P<0.05),相反,IL-33(50 ng/只鼠)处理明显减少损伤侧脑组织含水量(P<0.05),但是并未影响健侧半球和小脑脑组织含水量的变化(P>0.05)。(4)行为学数据表明,与Sham组比较,TBI明显诱导了神经行为功能损伤,而IL-33处理可明显改善神经运动功能缺损和学习记忆能力的损伤(P<0.05)。(5)ELISA实验结果显示,与Sham组相比较,TBI组可诱导血清中促炎细胞因子TNF-a和IL-1β表达(P<0.05),而IL-33、SAL或者IL-33+SAL处理显著下调了TNF-a和IL-1β的表达(P<0.05)。(6)免疫印迹分析结果显示,与Sham组相比较,TBI明显诱导了Bcl-2表达水平下调和CC-3表达上调,而无论在皮质还是海马区,IL-33、SAL或者IL-33+SAL处理均显著逆转了上述蛋白的表达(P<0.05)。(7)WB结果分析显示,TBI诱导了Beclin-1表达水平上调和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率的升高以及P62的表达的下降,而IL-33、SAL或者IL-33+SAL处理逆转了上述蛋白的表达。结论:(1)IL-33处理明显减轻TBI诱导的脑水肿和改善神经行为功能损伤。(2)IL-33在小鼠脑外伤模型中通过抑制炎症反应、细胞凋亡和自噬发挥了神经保护性作用。