肝脏糖原合成是机体维持糖代谢稳态的关键环节,而机体糖代谢紊乱与糖尿病和脂肪肝等代谢性疾病的发生密切相关。糖原合酶2（Glycogen Synthase 2,GYS2）是肝糖原合成的限速酶,其m RNA及蛋白表达量在小鼠肝脏呈现明显的昼夜节律性变化。生物钟基因Clock或Per2功能缺失小鼠肝脏的GYS2 m RNA及蛋白表达量均显著低于野生型（Wild Type,WT）小鼠,并失去昼夜节律性变化。哺乳动物中枢生物钟（视交叉上核,SCN）与外周生物钟（肝脏、肌肉和胰腺等）从多种层面协同调控糖代谢稳态。作为生物钟系统的核心转录因子,生物钟蛋白BMAL1功能缺失导致小鼠肝脏Gys2m RNA表达显著下降并丧失节律性,肝糖原合成受损。然而,BMAL1如何调控肝脏Gys2的节律性表达,进而如何影响肝糖原的节律性累积,目前尚不清楚,亟待进一步的深入研究。本研究以WT小鼠、Bmal1全身性敲除小鼠(Bmal1-/-)和Bmal1肝脏特异性敲除小鼠(L-Bmal1-/-)为模型,利用q PCR、Western Blot、PAS染色、原代肝细胞分离培养、双荧光素酶报告实验、实时生物荧光测定系统以及凝胶迁移实验（EMSA）等技术,解析BMAL1通过GYS2调控肝糖原节律性累积的分子机制。主要研究结果如下:1.分别在ZT和CT条件下,探究自由采食状态下WT小鼠肝脏生物钟基因与Gys2基因表达量、肝糖原含量以及血糖浓度的昼夜变化规律。q PCR结果显示,ZT和CT条件下WT小鼠肝脏生物钟基因（Per1、Per2、Per3、Bmal1、Clock、Nr1d1和Dbp）m RNA表达量以及Gys2基因m RNA表达量均存在昼夜节律性变化。PAS染色及肝糖原定量检测结果均显示ZT和CT条件下小鼠肝糖原含量存在明显的昼夜节律性变化。此外,血糖浓度在ZT条件和CT条件下亦存在昼夜节律性变化。上述结果提示生物钟可能在调控Gys2基因节律性表达和肝糖原节律性累积层面发挥重要作用,而光照对小鼠肝脏Gys2基因m RNA节律性表达和肝糖原节律性累积无显著影响。注:Zeitgeber Time（ZT）,将小鼠置于12 h光照:12 h黑暗的环境中,ZT0为光照开始,ZT12为光照结束;Circadian Time（CT）,将小鼠置于持续黑暗的环境中,CT0为主观光照的开始,CT12为主观光照的结束。2.在CT条件下,探究禁食处理后WT小鼠肝脏生物钟基因与Gys2基因m RNA表达量、肝脏糖原含量以及血糖浓度的昼夜变化规律。q PCR结果显示,禁食后WT小鼠肝脏生物钟基因（Per2、Per3、Bmal1、Clock、Nr1d1和Dbp）和Gys2基因m RNA表达量显著下降,但仍存在昼夜节律性变化。同时,PAS染色及肝糖原定量检测结果均显示禁食后小鼠肝糖原含量虽然随着饥饿时间的延长而急剧降低,但仍保持昼夜节律性变化。此外,禁食后的小鼠血糖浓度呈现总体下降趋势,但仍存在明显的昼夜节律性变化。上述结果进一步表明生物钟可能在调控Gys2基因节律性表达和肝糖原节律性累积层面发挥重要作用,而进食不是决定小鼠肝脏Gys2基因m RNA节律性表达和肝糖原节律性累积的必要条件。3.在CT条件下,探究Bmal1基因全身性敲除对小鼠肝脏GYS2 m RNA与蛋白表达量、肝糖原含量以及血糖稳态的影响。结果显示,Bmal1基因全身性敲除(Bmal1-/-)导致小鼠肝脏Clock、Per2、Nr1d1和Dbp基因的m RNA表达量显著下降,Per1和Cry1基因的m RNA表达量显著上升。相较于对照组小鼠,Bmal1-/-小鼠肝脏Gys2基因m RNA表达量亦显著下降,且失去节律性变化。同时,Bmal1-/-小鼠肝脏GYS2蛋白表达也显著下降。此外,PAS染色及肝糖原定量检测结果均显示Bmal1-/-小鼠的肝糖原含量显著下降,节律性丧失。小鼠肝脏原代细胞试验的结果进一步表明,Bmal1-/-小鼠GYS2m RNA及蛋白表达量均显著低于对照组小鼠。葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验显示,Bmal1-/-小鼠糖代谢能力异常,表现为葡萄糖耐量受损和胰岛素敏感性下降。4.在CT条件下,进一步探究Bmal1基因肝脏特异性敲除(L-Bmal1-/-)对小鼠肝脏GYS2 m RNA和蛋白表达量、肝糖原含量以及血糖稳态的影响。结果显示,Bmal1基因肝脏特异性敲除导致小鼠肝脏生物钟基因（Nr1d1、Dbp）m RNA表达量显著降低,而Clock和Cry1基因的m RNA表达量显著升高,其它生物钟基因（Per1、Per2）的m RNA表达量无显著性变化。与对照组小鼠相比,L-Bmal1-/-小鼠肝脏Gys2基因m RNA表达量亦显著下降,且失去节律性变化。同时,L-Bmal1-/-小鼠肝脏GYS2蛋白表达也显著下降。此外,PAS染色及肝糖原定量检测结果均显示L-Bmal1-/-小鼠肝糖原含量相比其对照组小鼠显著下降,且节律性变化减弱。小鼠肝脏原代细胞试验的结果进一步表明,L-Bmal1-/-小鼠GYS2 m RNA及蛋白表达量均显著低于对照组小鼠。葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验显示,L-Bmal1-/-小鼠糖代谢能力异常,表现为葡萄糖耐量受损和胰岛素敏感性下降。5.为进一步解析生物钟蛋白BMAL1调控Gys2节律性转录的分子机制,本研究构建了含有Gys2基因第7内含子末端两个E-box和E-box突变DNA序列的荧光素酶报告基因质粒。双荧光素酶报告实验结果显示,单E-box元件突变组和双E-box元件突变组的荧光素酶相对活性均呈现不同程度的下降,其中双E-box元件突变组的荧光素酶相对活性下降幅度最大,达到95%以上。利用Kronos AB-2550实时生物荧光测定系统,我们进一步发现双E-box元件突变组的实时荧光素酶活性大幅度低于野生型对照组,且失去节律性变化。EMSA结果表明,BMAL1蛋白与Gys2第7内含子的两个E-box元件存在特异性结合。综上所述,本研究发现Bmal1基因肝脏特异性敲除导致小鼠肝糖原合成受损,且节律性变化丧失,证实了小鼠肝糖原的节律性累积受到肝脏生物钟系统的直接调控。此外,本研究还进一步揭示了生物钟蛋白BMAL1通过Gys2基因第7内含子的两个E-box元件调控Gys2基因节律性表达进而影响肝糖原节律性累积的分子机制。本研究从生物钟角度更加全面认识了肝脏糖代谢调控网络,为进一步深入解析肝脏生物钟调节糖代谢稳态的分子机理提供了前期基础和理论依据,并为机体糖代谢相关疾病的防治提供了新的研究思路。