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为了解决器官移植供体来源的困难,用敲除异种免疫抗原基因的猪(能够降低移植的免疫反应),作为人类组织器官移植供体的研究报道很多。面对大量关节软骨损伤患者,难以解决用于移植的软骨或软骨细胞的来源问题,敲除GGTA1/B4GalNT2/CMAH三种表达异种免疫抗原基因猪(简称基因敲除猪)的软骨可以作为修复人类软骨的供体为本研究的假设。研究目的:评价敲除GGTA1/B4GalNT2/CMAH三种表达异种免疫抗原基因猪的软骨用于人类关节软骨修复的可行性。包括三部分内容:1)比较基因敲除猪和野生猪软骨细胞的生物学特性及其和移植相关的免疫原性,观察基因敲除猪的软骨细胞在减低免疫原性的同时,是否保留了软骨细胞的生物学特性;2)通过Gal抗原缺失模式小鼠模拟人体免疫环境,检测比较基因敲除猪软骨组织、野生型猪软骨组织分别植入模式小鼠皮下后的免疫反应,评价基因敲除猪软骨组织在人体内的免疫原性表现。3)通过力学检测比较基因敲除猪软骨组织、野生型猪软骨组织、人软骨组织的力学特性,评价敲基因处理是否影响了猪软骨的力学特性,以及基因敲除猪软骨组织力学是否满足人类软骨力学的要求。实验方法:1、获取GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织、野生型猪软骨组织,分离并体外培养基因敲除猪软骨细胞和野生型猪软骨细胞,观察细胞生长情况和形态;使用流式鉴定基因敲除猪软骨细胞和野生型猪软骨细胞的抗原表达情况。2、以Gal抗原缺失小鼠作为模式动物,将三基因敲除猪软骨组织与野生型猪软骨组织分别植入小鼠皮下作为实验组(KO组)与阳性对照组(WT组),以假手术组(con组)作为阴性对照;4周后取小鼠血清,检测并比较小鼠总IgM、IgG抗体含量,抗Gal IgM、IgG抗体水平,非Gal猪软骨IgM、IgG抗体水平,血清细胞因子含量,脾脏淋巴细胞分型。3、使用纳米压痕技术检测人软骨组织、基因敲除猪软骨组织、野生型猪软骨组织的弹性模量和硬度。实验结果:1、基因敲除猪软骨细胞的生长状况良好并具有与野生型猪软骨细胞相同的细胞学行为和细胞形态。流式细胞学结果显示野生型猪软骨细胞表达Gal抗原阳性率为96.88%,表达Sd抗原阳性率为13.92%,表达Neu5Gc抗原阳性率为90.93%。基因敲除猪软骨细胞表达Gal抗原阳性率为11.89%,表达Sd抗原阳性率为3.82%,表达Neu5Gc抗原阳性率为46.59%。2、小鼠血清中的总IgM、IgG抗体含量结果显示WT材料植入组小鼠总IgM、IgG抗体含量与KO组小鼠总IgM、IgG抗体含量之间不存在统计学上的显著性差异(P>0.05,但存在增高趋势)。三基因敲除猪软骨组织植入后其抗Gal IgM、IgG抗体的表达水平与WT组相比具有显著性差异,而与阴性对照组相比没有显著性差异。在血清特异性IgM抗体这一指标上,con组与KO组没有明显差异。在血清特异性IgG抗体这一指标上,con组与KO组有明显差异。血清细胞因子检测结果显示,IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-12p70在con组、WT组和KO组三组之间都不具有显著性差异(P>0.05)。脾脏淋巴细胞分型结果显示,在KO组与WT组之间CD4+T细胞和CD8+T细胞没有显著性差异(P>0.05,但存在增高趋势)。3、在弹性模量、硬度值这两个指标上,人软骨、KO猪软骨、WT猪软骨并没有显著性差异。实验结论:1、基因敲除猪软骨细胞并未因基因敲除而改变其软骨细胞的生物学特性;基因敲除猪软骨细胞与野生型猪软骨细胞相比表达Gal抗原、b4GalNT2抗原和Sd抗原的水平降低。2、异种软骨组织在皮下会引起免疫反应,基因敲除猪软骨组织在同等条件下所引起的免疫反应要比野生型猪软骨组织小。3、基因敲除猪软骨组织力学性能与人软骨、野生型猪软骨处在同一水平,并未因为基因敲除而影响力学性能,能够满足组织移植的力学要求。4、基因敲除猪软骨组织具有用于人类软骨修复的可能性,值得进一步研究。