论文部分内容阅读
作为自然界中储量仅次于纤维素的生物大分子,几丁质是昆虫的围食膜、植物病原线虫卵壳和植物真菌细胞壁的重要组成部分。它的主要功能是作为支撑身体结构的骨架,对机体起到保护作用。几丁质酶(EC 3.2.1.14)是一种可以降解几丁质的糖基水解酶,在农业上可作为生物防治剂,能提高植物的抗病虫害能力。本文将采集于武汉沙湖边的水样经过富集培养、初筛和复筛后,得到4株(MEW05、MEW06、MET14和MET32)能在1%胶体几丁质平板上有明显水解圈的菌株。摇瓶培养后MEW06菌株发酵上清液的几丁质酶的酶活力最高,可达71.74 U/mL。因此,MEW06被选为高产几丁质酶菌株进行进一步研究。MEW06经过28℃,24h培养后,菌落呈现圆形、鲜红色且边缘光滑。显微镜观察显示MEW06菌体近似球形短杆状、周生鞭毛、无芽孢以及无荚膜,革兰氏染色为革兰氏阴性,最后经过16SrDNA鉴定为粘质沙雷氏菌。MEW06发酵上清液经过硫酸铵沉淀、亲和层析和DEAE弱阴离子交换柱分离,并测定分离样品的蛋白质浓度和几丁质酶酶活力。结果表明,DEAE弱阴离子交换柱分离后样品比活力为14.67 U/mg、纯化倍数为9.17以及回收率为28.49%。分离得到的样品在SDS-PAGE中50 kDa的位置有单一条带。因此,MEW06的发酵上清液中包含蛋白分子量约为50 kDa的几丁质酶。MEW06菌株发酵上清液酶学性质研究的结果表明:MEW06菌株产几丁质酶的最适反应温度为45℃和pH为6,酶活力在25℃至65℃和pH 5至11之间相对稳定;Zn2+和K+可以促进MEW06几丁质酶酶活力,Mg2+、Fe2+、Mn2+和Ag+抑制MEW06几丁质酶酶活力;抑制剂对MEW06几丁质酶酶活力的抑制能力顺序为:SDS>NaN3>EDTA。MEW06基因组测序的结果表明:MEW06的基因组的大小为5.34Mbp,GC含量为60.99%,预测基因数量为5058个,基因平均长度为914 bp,Scaffold数量有48个。MEW06 基因组中包含 GM000046,GM002360,GM002904,GM003301 和 GM004442五种几丁质酶,其中GM002904和GM004442具有信号肽,去掉信号肽的分子量为58.55 kDa 和 44.45 kDa。MEW06不同的摇瓶发酵条件优化结果表明:MEW06产几丁质酶的最适条件为pH 7.0、温度31℃、接种量3%、装液量35%、摇床转速150 rpm和培养时间为48 h。响应面发酵条件优化后培养基配方为:淀粉17.5 g/L、胶体几丁质8/1000(wt/vol)、蛋白胨20 g/L、K2HPO4 0.56 g/L、KH2PO4 0.375 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L、ZnSO40.01 g/L。优化后发酵上清液几丁质酶酶活力达到了 197.32 U/mL,相较于初始培养基酶活力提高了 2.58倍。MEW06菌株发酵液和发酵上清液均可明显抑制苏云金芽孢杆菌BMB171的生长;MEW06菌株发酵液可明显抑制植物致病真菌草莓灰霉和苹果轮纹菌丝的生长;MEW06发酵液稀释4倍后,对秀丽隐杆线虫致死率为100%,对南方根结线虫的致死率为 58.74%。