【摘 要】
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N-糖基化介导的蛋白质的折叠成熟,糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚前体的合成以及转加到蛋白上形成GPI锚定蛋白均发生在内质网中。但新生成的GPI锚定蛋白此时仍然尚未成熟,需要经过一系列的结构重组才能成为成熟的蛋白。而结构重组的第一步就是肌醇脱酰基酶（PGAP1）介导的GPI脂质部分的肌醇脱酰基化反应,该反应发生在内质网中,对于GPI锚定蛋白高效的分选到运输囊泡必不可少。不同于其他错误折叠蛋白,错误折叠的
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N-糖基化介导的蛋白质的折叠成熟,糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚前体的合成以及转加到蛋白上形成GPI锚定蛋白均发生在内质网中。但新生成的GPI锚定蛋白此时仍然尚未成熟,需要经过一系列的结构重组才能成为成熟的蛋白。而结构重组的第一步就是肌醇脱酰基酶（PGAP1）介导的GPI脂质部分的肌醇脱酰基化反应,该反应发生在内质网中,对于GPI锚定蛋白高效的分选到运输囊泡必不可少。不同于其他错误折叠蛋白,错误折叠的GPI锚定蛋白并不依赖于内质网相关降解（ERAD）途径进行降解。在稳定状态下,绝大部分错误折叠的GPI锚定蛋白会被滞留在内质网中,当给予细胞一定的内质网压力时,它们会迅速的被释放到分泌途径中,短暂表达在细胞膜上,最终进入溶酶体降解。先前研究表明,内质网分子伴侣钙连蛋白的缺失会导致GPI肌醇脱酰基化效率降低。通过特异性的识别末端带有一个葡萄糖结构的N-糖链,钙连蛋白可以帮助蛋白质完成折叠。尽管钙连蛋白在蛋白质的内质网成熟过程中的作用已经被研究的相对透彻,但是其在GPI锚定蛋白的质量控制和结构重组中的具体作用仍有待研究。另外,先前有推论提出,GPI的肌醇脱酰基化反应是GPI锚定蛋白从蛋白质折叠状态转换到运输状态的检查点,但仍缺乏分子机制研究的支持。本研究在此基础上,证明了钙连蛋白/钙网蛋白循环在GPI锚定蛋白的成熟过程中扮演双重角色,并阐明了其分子机制。一方面通过识别末端带有葡萄糖的N-糖结构,钙连蛋白/钙网蛋白循环可以促进蛋白部分的折叠成熟,另一方面通过增加GPI锚定蛋白的内质网滞留时间,提高了PGAP1的肌醇脱酰基化效率。本论文的主要研究成果如下:1)钙连蛋白/钙网蛋白循环依赖的GPI肌醇脱酰基化作用广泛适用于带有N-糖基化修饰的GPI锚定蛋白。对于少数不带有N-糖基化修饰的GPI锚定蛋白来说,它们的肌醇脱酰基化反应则不依赖于钙连蛋白。通过对钙连蛋白的结构域活性位点进行突变,证明了其凝集素结构域在GPI锚定蛋白的脱酰基化反应中发挥了重要作用。免疫共沉淀实验表明,钙连蛋白可以与错误折叠的GPI锚定蛋白产生相互作用,且该结合作用依赖于GPI锚定蛋白的N-糖链以及膜结合域。2)钙连蛋白介导了错误折叠的GPI锚定蛋白的内质网滞留。在野生型细胞中,错误折叠的GPI锚定蛋白主要定位在内质网中。在CANX&CALR-DKO细胞中错误折叠的CD59（C94S）与CD55（C81A）主要定位在细胞膜上。在α-葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ缺失（MOGS-KO和GANAB-KO）的情况下,错误折叠的CD59（C94S）部分表达在细胞膜上。在野生型细胞WT中,N-糖修饰缺陷型错误折叠的CD59（N43Q,C94S）以及CD55（C81A,N95Q）主要表达在细胞膜上。以上结果表明钙连蛋白通过与蛋白上N-糖链的特异性结合,可以将错误折叠的GPI锚定蛋白滞留在内质网中。3)钙连蛋白在GPI锚定蛋白的成熟过程中起了辅助蛋白质折叠和促进肌醇脱酰基化的双重作用。少量表达在野生型细胞表面的错误折叠的GPI锚定蛋白可以被PI-PLC高效的切割,然而表达在CANX&CALR-DKO细胞表面的错误折叠的GPI锚定蛋白则表现出PI-PLC的切割抗性,表明其肌醇仍带有酰基链。在内质网压力诱导剂（毒胡萝卜素）的处理下,已经完成肌醇脱酰基化反应的错误折叠的GPI锚定蛋白会离开内质网而表达在细胞膜上。上述结果凸显了GPI锚定蛋白的内质网滞留作用对于GPI肌醇脱酰基化反应高效完成的重要性。4)充足的内质网滞留时间是PGAP1高效切割肌醇酰基链的必要条件。实验使用温度敏感型GPI锚定蛋白VSVGts-FLAG-EGFP-GPI（VFG-GPI）为模式蛋白,在四环霉素存在的情况下进行诱导表达。在40°C诱导条件下,VFG-GPI会因蛋白部分的错误折叠而被滞留在内质网中。当温度降低至32°C时,VFG-GPI会被释放到分泌途径中,最终表达在细胞膜上。应用VFG-GPI的上述特性,研究发现在32°C进行诱导时,CANX&CALR-DKO细胞表面的VFG-GPI相较于野生型细胞表现出PI-PLC切割抗性。如果在40°C高温条件下进行诱导表达24小时,后将温度降低至32°C,CANX&CALR-DKO细胞表面的VFG-GPI则表现出了PI-PLC切割的敏感性,表明其肌醇酰基链在内质网滞留过程中已经完成了高效切割。
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