枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为革兰氏阳性细菌的模式微生物与食品安全菌株,在基础科学以及工业发酵中均具有广泛应用。近年来,合成生物学与代谢工程等学科领域的发展为其提供了大量的基因操作和表达调控的工具,包括基于CRISPR-Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein,成簇的规律间隔短回文重复序列及CRISPR相关蛋白）的各类系统。由于生物体内代谢调控网络极其复杂且存在广泛的相互作用,个别位点的基因修饰与表达调控很难满足新一代微生物细胞工厂开发的需要。然而,目前B.subtilis中的基因编辑工具在可操作的位点个数和编辑效率上仍存在很大的不足,且系统的组合优化调控策略有待建立。本研究以B.subtilis为研究对象,基于CRISPR-Cas系统设计并构建了一系列便捷、高效、易用的多基因编辑与表达调控工具,并分别以外源性的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）和内源性的乙偶姻为目标产物,验证了上述系统在B.subtilis代谢改造中应用的有效性。主要研究结果如下:（1）在B.subtilis中构建了木糖诱导型的CRISPRi系统,并将其成功应用到了GlcNAc合成相关的多个竞争途径的组合动态调控中。首先,基于Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9在B.subtilis中设计构建了木糖诱导型的CRISPRi系统,使用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因时,最大弱化强度可达70.1倍;然后,利用该系统对GlcNAc合成的三个主要竞争途径（HMP、EMP及PSP）进行组合优化调控,共得到27个sg RNA array;对上述途径进行弱化后实现了葡萄糖和木糖的共利用,最优组合菌株BNX122的GlcNAc产量较对照菌株提高了21.4%,达到了18.7 g/L;在此基础上,进一步对木糖的添加时间和添加量进行优化,GlcNAc产量提高到20.5 g/L,RT-q PCR分析证实该调控策略的应用在转录水平上解除了B.subtilis中的分解代谢物阻遏效应;最后,在3-L发酵罐上进行了补料分批发酵,GlcNAc产量和生产强度分别达到103.1 g/L和1.17 g/L/h,为摇瓶上的5倍和2.7倍,总碳源转化率为0.44 g/g。（2）设计创制了基于生物传感器-CRISPRi的自发双重调控系统,并利用基于该系统的反馈遗传回路实现了GlcNAc合成相关代谢网络的可编程多模块协同调控。首先,在B.subtilis中基于转录因子GamR的调控机制设计了14个杂合启动子,选择其中三个可对胞内6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN6P）浓度产生响应且具有不同动态范围的启动子Pvg6、Pgam A与Psg2作为GlcN6P的生物传感器;随后,通过耦合基于CRISPRi系统的逻辑“非”门,实现了生物传感器信号的“正-负”转换,并进一步开发了可同时对不同基因进行激活和抑制的自发双重调控（autonomous dual-control,ADC）系统;然后,基于ADC系统设计构建了反馈遗传回路,用于GlcNAc合成模块及三个竞争模块的自发动态上调与下调,通过模块优化匹配使GlcNAc在摇瓶中的产量与转化率均较对照菌株提高了53%,分别达到28.0 g/L和0.37 g/g;最后,在15-L发酵罐中进行补料分批发酵,GlcNAc产量与转化率分别达到了131.6 g/L和0.38 g/g,证明上述遗传基因回路在大规模生物反应器中仍具有很好的稳定性与鲁棒性。（3）在B.subtilis中设计构建了基于CRISPR-Cpf1的多基因编辑系统,并利用该系统在B.subtilis 168中快速从头重构了GlcNAc的合成途径。首先,利用源于Francisella novicida U112的CRISPR-Cpf1系统,在B.subtilis中设计构建了可同时对多个位点进行操作的基因编辑工具,通过在该系统中引入Natronobacterium gregoryi的Argonaute（Ng Ago）蛋白显著提升了可操作的靶点个数和编辑效率,同时还开发了可以快速通过非磷酸化引物组装得到任意的crRNA阵列（Array）的SOMACA（synthetic oligos mediated assembly of crRNA array）方法;然后,选择B.subtilis中的六个非必需蛋白酶基因作为基因组编辑靶点,实现了双基因的同时敲除、六个基因的同时无义突变以及单个基因的基因组整合,上述过程的编辑效率均为100%;最后,通过外源基因GNA1的整合表达、关键调控位点glm S反馈抑制的解除与强化、GlcNAc降解途径与副产物生成途径的失活,在B.subtilis 168中快速从头构建了GlcNAc的合成途径。（4）在B.subtilis中基于CRISPR-Cpf1的构建了具有双重调节作用（上调与下调）的多基因表达调控系统,并利用其显著提高了内源性产物乙偶姻的合成能力。首先,通过对基于CRISPR-Cas9的木糖诱导型CRISPRi系统进行改造,构建了基于CRISPR-Cpf1的木糖诱导型CRISPRi系统,并进一步构建了IPTG诱导型的CRISPRi系统;随后,通过对Cpf1和crRNA array启动子的优化降低了该系统的渗漏表达,考察了IPTG浓度与抑制强度之间的关系,并通过设计的crRNA array实现了多基因的表达弱化;之后,选择10个不同来源的转录激活因子,将其分别融合到d Cpf1的C-末端,其中融合蛋白d Cpf1-Rem A可使目标基因的表达强度提高58%,而且该融合蛋白可以同时实现对于不同基因的激活和抑制;最后,设计并构建了一个可作用于多个靶点的crRNA array,对乙偶姻消耗途径中的关键基因（bdh A和aco A）以及副产物乳酸和乙酸合成中的关键基因（ldh和pta）的表达进行下调,并对合成途径中关键基因及其转录激活因子编码基因（als SD和als R）的表达进行上调,最终使乙偶姻产量提高了44.8%,达到25.8 g/L。