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呕吐毒素（DON）是小麦等谷物食品中污染最为严重的单端孢霉烯族真菌毒素,具有致吐、厌食等肠道毒性,而镉（Cd）是食品及土壤中污染最严重的有毒重金属之一,其从土壤到农作物的迁移速率极高,可污染大多数食品。DON和Cd在食物链中共同暴露产生蓄积作用,调研显示,黄河中游、东南沿海等谷物部分主产区同时是两者的中-高水平污染地区,谷物食品如面粉、面包等均受DON和Cd污染严重,因此人群面临DON+Cd的联合暴露风险。膳食摄入将导致肠道成为高水平DON和Cd同时作用的器官,且两者共同毒性作用于肠道,因而,对DON+Cd的肠道联合毒性研究十分必要。本文以肠上皮细胞HT-29模型和秀丽隐杆线虫慢性暴露模型相结合,通过体内、外模型联合评价DON+Cd的肠道联合毒性效应,探究其作用机制,并建立基于作用机制的可视化联合毒性筛查方法。主要研究内容如下:1.DON和Cd肠道毒性的体外模型建立与评价。通过八种细胞系的增殖活性测定,发现HT-29、Caco2等肠道细胞对DON有一定抵抗力,Compu Syn拟合DON暴露HT-29细胞12、24、48 h的IC50值分别为167.08、143.74、15.95μM,相应Cd的IC50值分别为157.47、44.42、6.60μM。基于IC50值分析,DON对HT-29细胞的毒性弱于Cd,但基于Fa-dose曲线分析,低剂量水平的DON毒性强于Cd。以此时间维度的毒性规律,设计模拟实际膳食平均暴露比（1:1,μM:μM）及DON的肠道合理浓度（0.84-33.78μM）和基于毒理终点效应(IC50:IC50,1/16 IC50-IC50)的体外多维联合染毒模型,从比率、时间和剂量角度分析DON+Cd的整体毒性趋势。结果显示,与单一毒物相比,等摩尔比率下DON+Cd联合染毒24、48 h整体毒性变强（κ>1）,12 h整体毒性变弱;IC50比率下联合染毒12、24 h整体毒性变强（κ>1）,48 h整体毒性变弱（κ<1）。该联合染毒模型为后续从时间维度和比率维度全面研究DON+Cd的联合毒性效应提供基础。2.基于HT-29模型毒性规律的DON+Cd联合效应研究。以CI模型分析,DON+Cd的联合毒性呈现时间导向和剂量导向的变化规律,两种染毒比率在长时染毒（24、48 h）中显示相似的联合作用趋势,但在短时染毒（12 h）有所不同。等摩尔比率下,低剂量的DON+Cd（DON≤6.75μM）随暴露时间的增加（12-48 h）从协同作用变为拮抗作用,而高剂量呈相反的联合作用趋势;在IC50比率下,低或中高等水平的DON+Cd(DON≤1/2 IC50)随时间（12-48 h）呈协同作用到拮抗作用的变化,而最高剂量(IC50)始终呈现协同作用。该联合效应的变化规律为后续探究DON+Cd的联合毒性作用机制提供剂量和染毒时间依据。3.基于DON+Cd对HT-29模型联合效应的mRNA调控及联合毒性作用机制分析。根据前述DON+Cd在时间维度的拮抗和协同作用变化规律,结合RNA-seq、流式细胞术和RT-qPCR,从分子水平和细胞功能响应水平,分析毒性机制。分子水平上,DESeq的重叠分析结果表明,DON对mRNA的调控效应受Cd影响,该调控效应并非加和结局,时间维度的响应符合前述毒性变化趋势（DON vs DON+Cd,5133个mRNA/24 h,2643个mRNA/12 h）。共享通路水平上,TNF-MAPK-AP-1-IL-1B信号级联参与DON+Cd的协同和拮抗效应;细胞功能响应水平上,DON+Cd上调ROS、Ca2+和MMP,加剧氧化应激失衡,导致紧密连接Claudin-2和Claudin-5的代偿上调。非共享通路水平上,脂肪合成与代谢（甘油磷脂、花生四烯酸、甾体、鞘糖脂）、氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）、蛋白质消化吸收、聚糖和免疫等与DON+Cd的协同作用有关;鞘糖脂、聚糖、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸、免疫等与DON+Cd的拮抗作用有关;上述10种毒性通路中有8种通路与脂肪代谢有关,说明脂肪代谢为DON+Cd联合作用的重要毒性机制。上述TNF、MAPK、氧化应激、脂肪代谢的机制分析得到RT-qPCR验证,并将在后续体内模型和体外筛查模型中进一步确证。4.DON+Cd慢性共暴露线虫模型构建及肠道毒性机制分析。在前述体外模型毒性机制分析的基础上,进一步分析模拟实际污染水平下DON+Cd联合暴露对线虫的肠道毒性效应,确证体外模型的氧化应激和脂肪代谢毒性机制。结果显示,DON对线虫的氧化应激和脂肪代谢干扰是其肠道毒性的重要作用机制,而Cd显著增强DON引发的体长发育抑制和摄食抑制,抑制率分别由22.38%和16.80%上升为33.92%和40.45%;Cd加剧DON引发的肠道ROS应激和脂褐素累积,削弱肠道hsp16.2应激;DON+Cd联合暴露显著调控POD-2（1.97×103倍）、CTL-2（1.62倍）、MTL-1（11.81倍）和MTL-2（15.68倍）等脂肪分解与合成、氧化应激和金属硫蛋白等基因。通过分子应激指标的相关性分析,发现ROS与摄食水平和体长发育高度负相关,明确了12种胁迫分子中存在23对高度关联的基因对。确证了DON+Cd联合暴露的肠道毒性效应是氧化应激和脂肪代谢综合作用的结果,与HT-29细胞模型的毒性机制结果相符。5.基于MAPK/AP-1信号转导的DON+Cd联合毒性传感筛查方法的建立。在前述TNF-MAPK-AP-1-IL-1B通路对DON+Cd响应的基础上,进一步解析AP-1家族应激,以特异性结合位点AP-1 site为毒性通路标志物,建立DON+Cd的联合毒性筛查模型。结果发现,DON显著上调FOSL2、FOSB、FOS和FOSL1等六种AP-1转录因子亚基,DON+Cd显著影响DON对FOSB和FOS的调控。基于AP-1 site串联序列的AP-1 site-mCherry-HEK293模型子代活力良好,mCherry信号对阳性底物响应稳定。与DON或Cd相比,0.5-10.0μM的DON+Cd诱导显著增强mCherry信号,该结果进一步验证前述HT-29模型的MAPK/AP-1毒性通路,且该荧光细胞传感器可用于DON、Cd及其联合毒性的简单可视化筛查。综上所述,本文设计模拟实际膳食暴露情况和基于毒理终点效应的DON+Cd联合暴露的体、内外研究模型,考察了短时、长时联合暴露下的肠道联合毒性作用规律,发现平均污染水平的DON+Cd慢性联合暴露导致肠道毒性的协同增强,明确了DON+Cd产生协同作用和拮抗作用的毒性作用机制,并基于所得毒性通路的转录因子,构建荧光细胞传感模型,实现接近实际污染水平的DON+Cd联合毒性的简单、快速、可视化筛查,为DON+Cd的联合毒性研究及联合毒性筛查奠定了基础。