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研究背景二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是工业上用途广泛的有机溶剂,也是纺纱原材料之一的粘胶纤维的生产原料。我国是纺织大国,粘胶纤维的产量持续高速增长,生产过程中CS2易挥发到生产环境中,对纺织女工的健康产生危害。研究发现CS2可致作业女工性腺机能障碍,胚胎早期流产和子代出生缺陷,具有明显的生殖毒性。前期研究发现小鼠围植入期CS2暴露会导致胚胎植入数目明显减少,并且子宫内膜细胞出现氧化应激和DNA损伤的现象。而氧化应激和DNA损伤影响胚胎植入的具体机制尚不完全清楚。胚胎的成功植入一方面需要母体子宫的容受性,另一方面有赖于胚胎正常的生长发育并获得着床能力,并且这两个过程需要保持时相一致性。近年来,细胞自噬在生殖过程中的作用成为关注重点。细胞自噬是一种保守的细胞内降解过程,在受精卵形成、植入前胚胎发育、胚胎植入和胎盘形成等多项生命过程中都有重要作用。自噬水平的变化可能会导致不良生殖结局的发生。多项研究发现,氧化应激和DNA损伤能够影响细胞自噬水平。CS2暴露导致的氧化应激和DNA损伤可能会引起孕鼠子宫和胚胎的细胞自噬水平异常,进而导致胚胎植入障碍。此外,研究发现精氨酸补充可以降低自噬水平,并且精氨酸能够调节细胞增殖。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作为精氨酸补充剂,常用于生殖干预研究。CS2暴露小鼠孕期膳食补充NCG可能通过改变自噬水平影响生殖结局。研究发现小鼠围植入期CS2暴露致胚胎毒性作用的最敏感的时期是孕第四天(GD4),因此本研究以GD4孕鼠暴露于CS2,建立CS2暴露致小鼠胚胎植入障碍模型,检测孕鼠子宫和胚胎组织自噬变化水平,探讨CS2暴露致胚胎植入障碍发生可能机制。并且对孕期小鼠进行NCG膳食补充,观察NCG补充后CS2暴露孕鼠的生殖结局以及细胞自噬改变情况,进一步验证细胞自噬变化在CS2所致胚胎植入障碍中的作用。研究目的构建CS2致小鼠胚胎植入障碍模型,观察暴露于CS2后孕鼠母体毒性和胚胎毒性及胚胎植入障碍现象,检测孕鼠子宫组织和胚胎组织自噬水平,探讨细胞自噬在CS2致小鼠胚胎植入障碍中的作用。对孕期小鼠膳食补充NCG构建膳食补充NCG并CS2暴露小鼠模型,检测孕鼠子宫组织和胚胎组织自噬水平,观察胚胎植入情况,验证细胞自噬在CS2致小鼠胚胎植入障碍中的作用。从母胎自噬水平角度探索CS2所致胚胎植入障碍的可能机制,为深入理解CS2暴露致生殖损伤机制提供科学依据。研究方法1.动物受孕及分组SPF级性成熟ICR种小鼠适应性喂养一周,按照雌雄比1：1合笼,次日晨8点检查阴栓,阴栓阳性记为孕1天(即GD1),并将其随机分到各个观察终点。每个观察终点含12只孕鼠,随机分配6只接受CS2暴露,另6只为溶剂对照。2.暴露时间和方式孕鼠于GD4接受腹腔注射一次CS2或者溶剂(CS2暴露剂量为631.4 mg/kg;溶剂对照为橄榄油；注射容量为0.1m1/10g体重)。膳食补充NCG实验中,孕鼠于GD1开始补充NCG直至观察终点,补充方式为膳食添加。膳食NCG剂量设计为0.1%(NCG重量占基础饲料的0.1%),根据小鼠每日进食量6-10g可以估算出每日NCG摄取量约为6-10mg(NCG补充剂量为240-330mg/kg)。增补NCG孕鼠在GD4接受CS2一次暴露。3.样本收集及子宫组织和胚胎组织自噬水平的测定于各观察终点收集孕鼠宫胚,-80℃冰箱保存备用。于GD9观察终点经脱臼处死孕鼠,称取子宫、卵巢、肝、脾、肾、胚胎的重量,并记录胚胎植入的数目。自噬水平的测定：运用ELISA和RT-PCR方法分别测定孕鼠宫胚组织中P62和BECN1蛋白含量和mRNA表达水平；运用RT-PCR方法测定孕鼠子宫组织和胚胎组织中P62、BECN1、ATG5及LC3B的mRNA含量。4.统计分析方法实验数据分析处理采用spss17.0软件,P<0.05认为有统计学意义。若数据符合正态分布且方差齐,采用两组独立样本的t检验比较暴露组与对照组两组之间的差异；不符合正态分布的数据则采用两组独立样本的t’检验比较暴露组与对照组之间的差异。研究结果1.CS2暴露后母体毒性和胚胎毒性母体毒性：妊娠期间各组动物总体重增加量、净体重增加量、子宫系数、卵巢系数、肝脏系数、脾脏系数和肾脏系数之间差异无统计学意义(P>0.05),提示CS2暴露所致母体毒性较小。胚胎毒性：①与对照组相比,CS2暴露组宫胚窝重、宫胚窝重系数均小于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),提示植入期暴露CS2后小鼠胚胎发育受到影响。②与对照组相比,暴露组胚胎植入数目明显降低(42.41%),差异有统计学意义(P<0.05),提示植入期暴露于CS2可以造成明显的胚胎植入障碍现象。2.CS2暴露后孕鼠母胎界面自噬水平变化情况植入期暴露于CS2后,在GD5观察终点孕鼠宫胚自噬水平较对照组有所下降。与对照组相比,CS2暴露孕鼠GD5观察终点宫胚组织P62蛋白表达水平增加38.64%(P<0.01),P62mRNA表达水平增加113%(P<0.01),BECN1 mRNA表达水平下降24%(P<0.01)。3.CS2暴露对孕鼠子宫组织自噬相关基因蛋白和mRNA表达的影响植入期暴露于CS2后,GD6和GD7观察终点孕鼠子宫组织自噬水平均有所降低。①GD6观察终点：与对照组相比,暴露组孕鼠GD6子宫组织P62mRNA表达水平增加20.59%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平下降33.91%(P<0.01),ATG5 mRNA表达水平下降20.04%(P<0.01)。②GD7观察终点：与对照组相比,暴露组孕鼠GD7子宫组织P62mRNA表达水平增加43.87%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平下降62.08%(P<0.01),ATG5mRNA表达水平下降19.23%(P<0.01),LC3BmRNA表达水平下降17.34%(P<0.01)。4.CS2暴露对胚胎组织自噬相关基因mRNA表达的影响植入期暴露于CS2后,GD6和GD7观察终点孕鼠胚胎组织自噬水平均有所升高。①GD6观察终点：与对照组相比,暴露组孕鼠GD6胚胎组织P62mRNA表达水平下降43.24%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平增加68.73%(P<0.01),ATG5mRNA表达水平增加22.37%(P<0.01),LC3BmRNA表达水平增加19.26%(P<0.05)。②GD7观察终点：与对照组相比,暴露组孕鼠GD7胚胎组织P62mRNA表达水平下降67.96%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平增加了67.36%(P<0.01)。5.NCG补充并CS2暴露的孕鼠母体毒性和胚胎毒性母体毒性： 暴露并NCG补充组孕鼠与对照组相比,总增重和净增重均有所增加(P<0.01),差异有统计学意义；暴露并NCG补充组孕鼠与暴露组相比,总增重和净增重也有所增加(P<0.01)。暴露并NCG补充组孕鼠子宫系数小于对照组(P<0.01),而与暴露组相比无差异(P>0.05)。各组动物卵巢系数、肝脏系数、脾脏系数和肾脏系数之间无差异(P>0.05)。胚胎毒性：与对照组相比,暴露并NCG补充组胚胎植入数目、宫胚窝重、平均宫胚窝重和宫胚窝重系数均无明显变化(P>0.05)。而与暴露组相比,暴露并NCG补充组胚胎植入数目增加130.89%(P<0.01),宫胚窝重、宫胚窝重系数也明显增加(P<0.01)。与暴露组相比,暴露并NCG补充组的平均宫胚窝重无明显变化(P>0.05)。6.NCG补充并CS2暴露的孕鼠子宫组织自噬相关基因mRNA表达水平的影响暴露并NCG补充组与暴露组相比,各观察终点自噬水平均发生改变。与暴露组相比,暴露并NCG补充组GD6孕鼠子宫组织P62mRNA表达水平下降24.37%(P<0.01),ATG5mRNA表达水平下降59.16%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平暴露并NCG补充组与暴露组相比差异无统计学意义(P>0.05)；GD7孕鼠子宫组织中P62mRNA表达水平下降16.33%(P<0.01),ATG5mRNA表达水平下降12.01%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平较暴露组差异无统计学意义(P>0.05)。7.NCG补充并CS2暴露对胚胎组织自噬相关基因mRNA表达水平的影响与暴露组相比,暴露并NCG补充组孕鼠胚胎组织自噬水平在各观察终点均有所下降。暴露并NCG补充组GD6胚胎组织较暴露组胚胎组织BECN1mRNA表达水平下降96.75%(P<0.01),ATG5mRNA表达水平下降51.20%(P<0.01),P62mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。暴露并NCG补充组GD7胚胎组织中P62mRNA表达水平增加27.95%(P<0.01),BECN1mRNA表达水平下降25.70%(P<0.05),ATG5mRAN表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.孕鼠胚胎植入期暴露于CS2可导致子宫组织自噬水平下降,胚胎组织自噬水平的增高。CS2暴露后孕鼠子宫和胚胎自噬水平的变化可能是CS2致胚胎植入障碍的机制之一。2.胚胎植入期CS2暴露并增补NCG可缓解CS2暴露导致的胚胎植入障碍现象。3.孕期补充NCG能明显改变CS2暴露孕鼠子宫和胚胎组织自噬水平,其中暴露并NCG补充组胚胎组织的自噬水平明显低于暴露组。孕期补充NCG后暴露于CS2孕鼠子宫和胚胎组织的自噬水平变化可能是NCG缓解CS2暴露致植入障碍的重要原因。