研究背景肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发癌肝癌类型,并且是全球范围内威胁人类健康的一个重要的医疗问题。在我国肝细胞癌排名为第四位最常见的肿瘤和第三位导致癌症死亡的主要原因。因为HCC发病隐匿,按照2017版《中国原发性肝癌诊疗规范》,对易患HCC的高危人群推荐超声检查(Ultrasonography,US)、及甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)血清学检测作为筛查。但是研究发现,常规US检查诊断早期HCC的灵敏度及特异度较低,而约30%的HCC可以是AFP阴性。因此早期HCC及AFP阴性的HCC不被易发现,当确诊时病情已进展为中晚期而不能根治。另外,HCC治疗后容易出现复发,尤其对于早期及AFP阴性的HCC患者,目前缺乏简便而有效的血清学指标来评估介入疗效及判断患者的预后。Midkine(MDK)是一种肝素结合生长因子,研究发现MDK在正常人体及肝硬化患者血清中为低表达,而在HCC患者的血清中则为高表达,血清MDK检测HCC的敏感性及特异性均优于AFP,可能有利于HCC的早期诊断。但有报道显示,MDK与肿瘤的直径、数量、肿瘤分期,及AFP水平之间存在无显著相关性。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)是指存在于患者外周血中的具有多种类型的肿瘤细胞。经研究发现CTC的存在是肿瘤细胞自发,或者因为诊疗操作过程中,肿瘤细胞从原发病灶或者肿瘤转移灶上脱落并且进入外周血液循环形成CTCs,是肿瘤侵袭和转移的初级阶段,其计数被用来作为多种肿瘤的预后判断。研究发现CTCs细胞亚型的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可导致细胞转移侵袭性更高,可能导致患者较差的预后。目前对于外周血MDK、CTC计数在HCC尤其是早期或AFP阴性的HCC的诊断,及介入疗效的评估的对比缺乏系统研究的文献报道。目的本研究拟对确诊为HCC的初诊患者介入治疗前后外周血AFP、MDK及CTCs计数及分型分析进行检测,并以同期的肿瘤影像学结果作为标准对照,探讨1)检测患者外周血MDK及CTCs计数是否可作为辅助HCC诊断的有效生物学标记物。2)相比AFP,外周血MDK及CTCs计数对HCC的检出率是否具有优势。3)AFP、MDK及CTCs计数及亚型分析与肿瘤临床病理参数是否有相关性。4)外周血MDK及CTCs计数在HCC患者中的表达是否有相关性。5)相比AFP,外周血MDK及CTCs计数及亚型分析对HCC患者疗效评估的价值如何。6)外周血MDK及CTCs计数对HCC患者介入后的预后判断是否有指导意义。方法2016年1月至2017年6月入组84例HCC患者及对照组的24例肝血管瘤患者,检测治疗前患者的外周血AFP、MDK、CTCs计数及CTCs亚型分析。其中84例肝细胞癌患者中,27例Ⅰ期患者接受了射频消融治疗,29例Ⅱ期患者接受了肝动脉化疗栓塞治疗(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)治疗,28例Ⅲ期患者接受了 TACE联合口服索拉非尼治疗。治疗后每2个月随访一次,全部HCC患者检测外周血AFP、MDK、CTCs计数及CTCs亚型分析,并做核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)上腹部平扫及动态增强扫描及胸部电子计算机断层扫描(Computed Tomography,CT)平扫检查,根据影像学结果评价是否再行介入治疗。共随访18个月,记录疾病进展时间(Time to progression,TTP)。应用 SPSS 18.0软件进行统计分析。以AFP≥20ug/l,MDK≥0.654ng/ml,CTCs计数≥3个/5ml为阳性值。使用x2检验比较AFP、MDK、CTC计数的HCC阳性检出率,并评估MDK、CTC亚型等指标治疗前后的变化与疗效评价敏感性的关系。运用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristics,ROC)评估AFP、MDK、CTC计数诊断HCC的灵敏度,特异度和曲线下面积(AUC,Area Under Curve)与95%置信区间(CI,Confidence Interval)。比较MDK、CTC在早期HCC或AFP阴性HCC中的阳性率。对数据行正态分布检验,并用秩和检验评估AFP、MDK、CTCs计数、CTCs亚型在不同临床肿瘤参数组间的差异,及治疗后上述肿瘤学标记物变化与疗效比较。Spearman相关分析方法评估AFP、MDK、CTCs计数、CTCs亚型与各临床肿瘤参数之间的相关性。用LogRank(Mantel-Cox)法进行回归分析评估MDK、CTC对HCC预后判断的意义。所有P值均为双侧,P<0.05具有统计学意义。结果外周血AFP、MDK、CTC计数的HCC阳性检出率比较结果:本研究的84例HCC患者中,外周血AFP、MDK及CTC计数的阳性检出率分别为51.2%,95.2%,73.8%,三者间两两比较差异有统计学意义。外周血AFP、MDK、CTC计数对HCC检测的敏感度、特异度及准确率的比较:AFP的HCC诊断敏感度为51.2%,特异度为100%,准确度为62.04%。MDK的HCC诊断敏感度为95.2%,特异度为95.8%,准确度为95.37%。CTCs计数的HCC诊断敏感度为73.8%,特异度为91.7%,准确度为77.78%。外周血AFP、MDK、CTC计数三者曲线下面积(AUC)的比较结果:AFP、MDK、CTC计数ROC曲线下面积分别为0.709,0.995,0.829。三者两两比较结果:AFP与MDK、CTC的AUC差别均有统计学意义;MDK与CTC的AUC差别无统计学意义。外周血MDK与CTC计数在AFP阴性HCC及早期HCC患者的阳性检出率比较结果:MDK与CTCs在AFP阴性组HCC的阳性率分别为95.12%,65.85%,早期HCC亚组MDK与CTC阳性率分别为83.33%,0.00%。外周血AFP、MDK、CTC计数在早期HCC患者阳性检出率比较结果:AFP 的阳性率为 55.56%,CTC 为 29.63%,MDK 为 85.19%。外周血AFP、MDK、CTC计数及分型与肿瘤不同临床参数分组的比较及相关性分析结果:血清AFP与肿瘤数目、肿瘤大小、有无血管侵犯、肝癌临床分期各组差异均无统计学意义,且与以上临床参数无相关性。血清MDK与肿瘤数目、肿瘤大小、有无血管侵犯、肝癌临床分期各组差异均有统计学意义,且与肿瘤数目及临床分期有正相关性。外周血CTC计数与肿瘤数目、肿瘤大小、有无血管侵犯、肝癌临床分期差异均有统计学意义,且与以上临床参数均有正相关性。外周血CTC分型与肿瘤数目、有无血管侵犯、肝癌临床分期差异均有统计学意义,与肿瘤大小差异无统计学意义。外周血AFP、MDK、CTCs计数的相关性分析结果:外周血AFP、MK与CTC计数均有正相关性关系。介入治疗前后AFP、MDK、CTC计数阳性率变化与疗效敏感性评价的比较结果:HCC介入治疗后外周血AFP、MDK的阳性率均明显低于介入治疗前水平,AFP、MDK差异有统计学意义,CTC差异无统计学意义。治疗后外周血AFP、MDK、CTC计数的数值变化在介入疗效评价中的比较结果:外周血AFP、MDK、CTC计数在治疗后有效组的数值均明显低于治疗后无效组,差异有统计学意义。介入治疗前后CTC亚型分析结果:CTC上皮型亚型治疗前阳性率低于治疗后阳性率,差异有统计学意义。混合型、间质型亚型治疗前阳性率高于治疗后阳性率,差异无统计学意义。外周血MDK、CTC检测对HCC介入治疗预后的分析:介入前MDK、CTC阳性的HCC患者,较阴性的患者更易出现疾病进展,差异有统计学意义。结论1.外周血MDK、CTCs计数可作为辅助HCC诊断的有效生物学标记物。2.对于早期HCC或AFP阴性HCC的检出率,MDK较CTC更具有优势。3.MDK在肿瘤数目、肿瘤大小、有无血管侵犯、肝癌临床分期各组间有显著性差异,外周血MDK与肿瘤数目及临床分期有正相关性。4.HCC患者外周血MDK与CTCs计数成正相关性。5.外周血CTC计数在肿瘤数目、肿瘤大小、有无血管侵犯、肝癌临床分期各组间有显著性差异,且外周血CTC计数与以上临床参数均有正相关性。外周血CTC亚型在肿瘤数目、有无血管侵犯、肝癌临床分期各组有显著性差异。6.外周血MDK及CTCs计数及分型分析对HCC患者介入后的疗效评估、患者预后分析有指导意义。外周血MDK、CTC术前阳性的HCC更容易出现术后肿瘤进展。