糖基化修饰是蛋白质最普遍、最复杂的翻译后修饰之一,动物体内约有1/2的蛋白质发生了糖基化修饰。研究表明蛋白质糖基化在许多生命活动中起着重要的作用,如参与细胞的信号转导、免疫应答、精卵结合等。异常蛋白糖基化与疾病的发生直接相关,在许多疾病如糖尿病、传染病、癌症的发生发展过程中都检测到蛋白糖基化修饰的改变。而糖基化位点的综合分析将有助于更好地了解蛋白质糖基化的生物学功能。目前N-糖基化位点方面的研究方法已有较多报道,但是将亲水相互作用法富集糖肽结合三氟甲基磺酸法和酶法去糖基化进行N-糖基化位点综合分析的方法还未见报道。本研究的创新点在于利用医用脱脂棉制备的棉花亲水色谱柱进行糖肽的富集,简化了实验操作。采用三氟甲基磺酸法进行去糖基化处理避免O-糖基化位点干扰,同时在N-糖基化位点处残留一个GlcNAc作为质量标签,降低了对质谱灵敏度的要求。同时结合酶法去糖基化得到的糖链数据,对N-糖基化位点进行了综合解析。我们以唾液酸化糖肽和牛胰核糖核酸酶B为标准品进行方法验证,同时又将该方法成功运用到大豆β-conglycinin蛋白的糖基化位点鉴定中,对于糖蛋白质组学研究具有重要意义。研究结果如下:1.运用棉花亲水色谱柱规模化的从鸡蛋卵黄中分离纯化唾液酸化糖肽,与之前方法相比该方法简化了实验操作、缩短了时间,我们仅用一周时间便从100个鸡蛋卵黄中纯化到600 mg唾液酸化糖肽。该方法可以用于唾液酸化糖肽制备,具有很好的应用前景。2.成功鉴定了唾液酸化糖肽的糖基化位点为:KVAN~#KT,该糖基化位点处修饰的N-糖链为H5N4A2。接着对牛胰核糖核酸酶B经trypsin酶解后的糖肽成功进行了富集,鉴定出糖基化位点为:N~#LTK,并解析出糖基化位点处修饰的5条N-糖链分别为:H5N2、H6N2、H7N2、H8N2、H9N2。3.利用棉花亲水柱成功富集到大豆β-conglycinin蛋白经trypsin酶和pepsin酶复合酶切后的22条糖肽,成功鉴定出了β-conglycinin蛋白三个亚基:α亚基、α,亚基、β亚基的5个糖基化位点:ILN~#GTA、PVMVN~#A、VVN~#ATSNL、LIVILN~#GTA、PVVVN~#ATSNL。同时我们也对糖基化位点处的糖链进行解析,共发现4条高甘露糖型N-糖链:H5N2、H6N2、H7N2、H8N2。