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动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)及其并发症是威胁人类健康的“第一杀手”。AS的发生是一个多种因素在多层次上综合作用的过程。血脂水平的升高伴随着单核细胞活化成为巨噬细胞以及大量氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)的生成,随之巨噬细胞在一系列信号分子的介导下吞噬ox-LDL形成泡沫细胞。泡沫细胞的形成是AS早期变化的特征性标志,也是AS斑块损伤形成、发展和崩解的关键。因此,在广泛使用调脂抗炎药物防治AS的同时,抑制巨噬源性泡沫细胞的形成作为AS治疗的新策略日益受到重视。我室前期对AS发生过程中差异表达基因的研究表明,整合素家族的基因包括integrinβ1、integrinβ2、integrinα6等均显著上调;对AS过程中关键基因筛选、鉴定及三七总皂苷(total saponins of Panax notoginseng, PNS)调控作用的研究发现,整合素家族表达上调作用尤为明显,对整合素家族的调控是PNS防治AS的关键环节。整合素β1(integrinβ1)在AS发生早期主要介导了单核细胞与血管内皮的黏附,但是在巨噬细胞吞噬ox-LDL形成泡沫细胞的过程中是否发挥作用及其相关机制未见报道。为此,本课题应用RNA干扰技术探讨integrinβ1对泡沫细胞形成的影响及其初步机制,为AS的防治提供新的靶标。方法:1.检测RAW264.7细胞的转染效率:RAW264.7细胞用含10% FBS的DMEM培养基传代培养至30%-50%融合后,分为Cy3标记siRNA转染组和空白对照组。转染组用lipo2000脂质体试剂将Cy3-siRNA转染到RAW264.7细胞中,空白对照组除了不加转染试剂和siRNA外其他操作相同。转染8h后,置于荧光显微镜下绿光(G)激发,观察细胞内的红色荧光表达情况。2.筛选最有效的siRNA:针对integrinβ1基因的不同靶点设计3条siRNA。RAW264.7细胞用含10% FBS的DMEM培养基传代培养至30%-50%融合后,用lipo2000脂质体试剂分别将siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNANC转染到RAW264.7细胞中,另设空白对照组,不加任何转染试剂,转染试剂对照组,只加lipo2000脂质体试剂,不加siRNA。转染24h后,应用Real-time PCR检测integrinβ1基因mRNA表达水平。3.RAW264.7细胞用含10% FBS的DMEM培养基传代培养至30%-50%融合后分为siRNA1转染组、siRNANC阴性对照转染组、空白对照组、转染试剂对照组4组,各转染组分别用lipo2000脂质体试剂将siRNA和siRNANC转染到RAW264.7细胞中,空白对照组正常培养,不加任何转染试剂,转染试剂对照组只加lipo2000脂质体试剂,不加siRNA。转染24 h后,黏附实验测定各组细胞的黏附率。4.RAW264.7细胞用含10% FBS的DMEM培养基传代培养至30%-50%融合后分为siRNA1转染组、siRNANC阴性对照转染组、空白对照组、转染试剂对照组4组,各组处理同前。转染6 h后,用含ox-LDL(25 mg/L)的DMEM培养液诱导培养各组细胞18 h后,脂质化学染色法测定各组细胞的泡沫细胞转化率,胆固醇氧化酶终点法测定各组细胞内的总胆固醇含量,原子力显微镜观察各组细胞膜上的小凹结构,western blot检测各组细胞膜上清道夫受体CD36的表达水平。结果:1.转染效率:荧光显微镜下观察转染Cy3标记siRNA的RAW264.7细胞中有红色荧光表达,提示转染试剂lipo2000能成功将siRNA转染到细胞中,且转染效率可高达98%。2.最有效siRNA的筛选:3条siRNA对integrinβ1 mRNA表达的沉默效率分别为65%、50%和58%。因此后续试验选用siRNA1进行。3.有效沉默RAW264.7细胞的integrinβ1基因表达后,与对照组相比,其黏附功能显著降低(P < 0.01);ox-LDL诱导培养后,siRNA转染组泡沫细胞转化率明显降低(P < 0.01),总胆固醇显著减少(P < 0.01);原子力显微镜观察到siRNA转染组的细胞膜上小凹结构减少,WB结果显示siRNA转染组CD36表达降低(P < 0.01)。结论:1.沉默integrinβ1基因能有效减少RAW264.7细胞对ox-LDL的摄取,抑制泡沫细胞的形成。2.沉默integrinβ1基因抑制泡沫细胞形成的机制可能与降低清道夫受体CD36的表达和减少细胞膜表面的小凹相关。