软骨的畸形、缺损是临床常见疾病之一，由于不含神经、血管等组织，软骨再生能力极差，怎样修复软骨组织缺损一直以来是临床难以解决的问题。目前，组织工程技术的出现有望解决这一难题，通过选择适当的种子细胞、生长因子、支架材料及适宜的生长环境，利用软骨组织工程技术已在体内外构建出具有一定形态的软骨组织，并有临床可行性。骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem cells，BMSCs）具有很强的增殖能力及多向分化潜能，可在一定的环境下诱导分化为软骨细胞，可作为种子细胞广泛应用于软骨再生修复。富血小板纤维蛋白（Platelet-richfibrin，PRF）作为一种富含血小板和白细胞的生物材料，含有多种生长因子的同时为细胞的迁移、黏附提供了场所。本课题组前期采用我们的专利技术将PRF膜片与BMSCs膜片复合后，成功构建BMSCs/PRF双膜复合体移植材料，并证实该复合体在适宜的体内外环境中可以成功生成组织工程软骨进而在软骨再生与修复中具有良好的应用前景。另外，由于关节软骨在体内不可避免地要受到生物力刺激，力学刺激影响软骨细胞的代谢与生长因子分泌，并在关节软骨的生长、发育以及结构与功能维持的过程中起重要的作用，一旦软骨组织工程种子细胞在体外培养时缺乏有效的生物力刺激，会导致所生成的软骨组织细胞排列不规则、软骨基质含量少，并且所含的胶原纤维较细，所构建的组织工程软骨力学性能也就较差且形态不佳，无法达到成功修复关节软骨缺损的目的。因而，本课题组前期通过对PCNA、Sox-9、Aggrecan、Col-Ⅱ基因表达水平的检测，已筛选出适当的力学刺激加载方式，即120KPa、1h/d、连续4d的静态液压加载，当该力学刺激作用于BMSCs/PRF双膜复合体后，在体外可显著地促BMSCs成软骨分化；并通过裸鼠皮下以及关节软骨缺损区移植证明，该力学刺激的预调可以明显促进BMSCs/PRF双膜复合体的体内成软骨能力。骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMPs)是从骨基质中分离得到的一类酸性糖蛋白，能高效诱导骨及软骨组织的发生，BMPs不仅是有效的促软骨分化因子同时也是敏感的力学信号转导分子，BMPs信号通路在软骨形成过程中有着重要的作用。那么，在本研究前期所观察到的压力促BMSCs/PRF双膜复合体成软骨分化的过程中，BMPs信号是否参与了力学信号的转导？BMPs信号与压力促BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应有着怎样的关系呢？本实验即通过构建BMSCs/PRF双膜复合体，继而模拟体内受力环境，从分子学角度出发，观察压力刺激兔BMSCs/PRF双膜复合体后BMPs信号相关分子的表达，探讨BMPs在压力调控兔BMSCs/PRF成软骨响应过程中的具体作用及其信号途径，以期待从BMPs信号角度揭示压力刺激BMSCs/PRF双膜复合体成软骨效应中的力学信号转导机制。本研究分为三个部分：第一部分：利用骨髓穿刺法抽取兔骨髓血，通过密度梯度离心法分离、培养兔BMSCs并行形态学观察至P3代，经流式细胞术鉴定和多向分化诱导实验（成骨分化和成脂分化），确定本实验所培养的兔BMSCs具有组织工程种子细胞的特点。将BMSCs培养至P3代，通过膜片诱导液诱导10-14d后，成功构建出细胞膜片结构；抽取自体兔耳中央动脉血10ml，以3000r/min离心10min、静置10-15min，获取PRF凝胶，挤出多余液体后可获PRF膜片结构；按照本课题组前期申请的国家发明专利（实质审查阶段）：一种干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜复合体移植材料的制备方法，将自体BMSCs膜片与自体PRF复合形成BMSCs/PRF双膜复合体。第二部分： BMSCs/PRF双膜复合体采用课题组自行研发制作的细胞液压加载装置，按照前期筛选出的对体外培养BMSCs/PRF双膜复合体能够产生良好促软骨分化效应的生物力学刺激条件：120KPa、1h/d、连续4d静态液压分别对BMSCs和BMSCs/PRF双膜复合体进行加载，无压力刺激时，BMSCs/PRF双膜复合体和BMSCs膜片在常规培养液培养4d，通过Real-time PCR和Western Blot技术，检测BMPs信号通路相关分子基因和蛋白情况的表达。结果显示：120KPa、1h/d、连续4d的力学刺激无论是作用于BMSCs还是BMSCs/PRF双膜复合体后，BMP2、BMP受体（BMPRⅠB、BMPR2）以及Smad1、Smad5的基因及蛋白水平均上调；而无压力刺激时，BMSCs/PRF双膜复合体常规培养4d后，BMPs相关分子表达无明显上调。提示，在适当的生物力学作用下，BMPs信号相关分子可以感应到力学信号的刺激，而将信号传递至胞内发挥其相应的作用，BMPs信号通路参与了压力促BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应过程。第三部分：为了探索在单次加载过程中，BMPs信号分子激活的时效性，对BMSCs和BMSCs/PRF双膜复合体给予120KPa持续加载120min，无压力刺激时，BMSCs/PRF双膜复合体和BMSCs膜片在常规培养液中培养120min，分别在0、30、60、90、120min五个时间点，通过Real-time PCR和Western Blot检测BMPs相关分子基因和蛋白的表达。结果显示：无论是BMSCs还是BMSCs/PRF双膜复合体，在120min持续压力加载过程中，60min时BMP2及BMPs信号通路相关分子基因和蛋白的表达均最佳，无压力刺激时，BMSCs/PRF双膜复合体常规培养，不同时间点检测BMPs信号通路相关分子表达均无明显差异。提示：在120min的持续加载过程中，60min时BMPs信号通路相关分子表达最佳，从分子角度证明了实验前期筛选的持续性加载1h时长的可行性，并且进一步说明BMPs信号是压力调控BMSCs/PRF双膜复合体产生效应的重要分子机制之一，而单纯富含复合生长因子的PRF作用并不能有效激活BMSCs中的BMPs信号通路。通过Western Blot技术，对BMPs信号在压力调控兔BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应中的作用进行研究。结果显示兔BMSCs/PRF双膜复合体在给予单次60min、120KPa持续压力加载时，软骨细胞特有的细胞外基质Ⅱ型胶原（Collagen type two，Col-Ⅱ）、蛋白多糖（Aggrecan）的蛋白表达升高；加入外源性BMPs抑制剂Noggin后，相同力学刺激后Col-II和Aggrecan表达的下调。提示压力促进BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应中BMPs信号通路有着重要的作用。实验结论：在课题组前期证明的促BMSCs/PRF双膜复合体成软骨响应的生物力刺激条件（120KPa、1h/d、连续4d的静态液压加载）作用下，BMSCs/PRF双膜复合体中BMPs信号通路相关分子BMP2、BMP受体（BMPRⅠB、BMPR2）及Smad1、Smad5表达均明显上调，而无压力刺激的静态BMSCs/PRF双膜复合体培养组并未见到BMPs信号通路的激活，说明BMPs信号通路参与了压力促BMSCs/PRF双膜复合体成软骨过程中的力学信号传导；进一步分析单次压力加载中BMPs活化的时间效应，发现：120min的持续加载过程中，120KPa持续60min时BMPs通路信号分子表达最强，从另一个角度说明了本实验组前期选择的1h加压时长的可行性；另外，当给予BMPs信号阻断剂后，同样的压力刺激不再能引起Smad1、5的活化，并且Col-II和Aggrecan表达下降，说明在120KPa、持续60min的压力刺激促兔BMSCs/PRF双膜复合体软骨向分化的效应中BMPs/Smad信号发挥着重要的作用。