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背景:动物实验和初期的临床研究表明干细胞移植可以取代坏死心肌细胞、增加有功能的心肌细胞数量,增加心梗区域血管的密度,改善心功能,从而为心肌梗死的治疗开辟了一条崭新的途径。但干细胞在移植早期的大量缺失影响了干细胞移植的治疗效果。在体内外的实验中均证实AKT1基因的过表达能明显抑制细胞的凋亡,本试验使用干细胞自体移植联合转染AKT1基因治疗,来研究过表达AKT1的骨髓干细胞能否在体内外的缺氧和乏营养状态下抑制干细胞的凋亡,增加干细胞修复受损心肌的治疗效果,并进一步探讨干细胞治疗缺血性心肌病的机理。第一部分Akt1-cDNA表达载体的构建目的:克隆AKT1的cDNA,将其与表达载体结合,构建成AKT1-cDNA表达载体。方法:根据已经公布的AKT1的CDS功能区的基因序列,应用RT-PCR技术从Hep G2细胞中扩增AKT1-cDNA基因(1442bp) ,并将其克隆至载体pCDH1-MCS1-EF1- copGFP,构建AKT1-cDNA表达载体,并将其转染DH5α感受态细菌。选择阳性克隆菌,行双酶切鉴定和测序验证所获取的cDNA。结果:双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的cDNA为AKT1的CDS功能区基因。结论:成功构建AKT1-cDNA表达载体。第二部分用慢病毒系统建立AKT1基因过表达的稳转骨髓干细胞目的:使用慢病毒包装系统(pPACKH1- Lentivector Packaging Kit)在体外建立稳定过表达AKT1基因的稳转骨髓干细胞。方法:结合AKT1-cDNA的穿梭质粒pCDH1转染包装细胞293T细胞进行扩增后,使用由三个质粒组成的慢病毒转染系统进行基因重组,并以其为载体转染猪的骨髓干细胞,检测其荧光的表达。再抽提蛋白后,行Western blot检测蛋白的表达。realtime RT-PCR实时荧光定量检测技术(Sybergreen用于荧光指示,GAPDH作为管家基因)用于实时检测原代细胞和转基因细胞的AKT1的mRNA水平。结果:转染入293T细胞和MSCs24和48小时后,均可检测到强荧光出现。Western blot免疫印迹技术表明其蛋白表达产物的分子量与已知分子量相符,real time RT-PCR实时荧光定量检测结果表明转染两周后的MSCs能稳定转录AKT1,其AKT1-mRNA的转录水平是原代细胞的120倍。结论:使用携带目的基因AKT1的慢病毒系统转染猪的骨髓干细胞可使其长期稳定过表达AKT1。第三部分猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养和心梗模型的建立目的:从猪的骨髓中分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)以及建立猪的阻塞前降支造成的缺血性心肌病的动物模型。第一节猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养目的建立猪骨髓间充质干细胞体外培养方法,为细胞心肌成形术提供新材料。方法猪的骨髓MSCs分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期。结果体外培养的原代MSCs 10～14d达到融合,细胞周期显示73%的细胞处于G0/G1期。结论根据黏附特性分离的猪骨髓MSCs在体外条件下可生长扩增,可用于细胞心肌成形术。第二节猪心肌梗死模型的建立目的经心导管用明胶海绵栓子栓塞猪的冠状动脉左前降支(LAD),建立心肌梗死的大动物模型。方法对6头猪用明胶海绵经导管栓塞LAD,致前室壁梗死。4周后行心脏超声、磁共振、冠状动脉造影及组织学检查。结果与对照组相比,心梗(MI)组左室舒张未内径(LVEDd)增大(P<0.05),射血分数(EF)下降(P<0.05);每搏输出量(SV)明显下降(P<0.05),舒张末期室壁厚度(EDWT)明显变薄(P<0.05)。复查冠脉造影提示LAD栓塞仍存在。MI组前室壁、室间隔形成了透壁梗死灶。结论这种模型接近临床病理生理过程,稳定可靠。第四部分转入AKT1基因的骨髓干细胞和原代细胞体外凋亡的检测比较目的:比较AKT- MSCs、MSCs和转慢病毒空载体的MSCs在体外缺氧乏营养的环境中的凋亡情况,验证体外过表达AKT1可以明显减少干细胞的凋亡。方法:获取MSCs,转慢病毒空载体的MSCs(无AKT-cDNA)和AKT- MSCs,三种细胞在无培养基、1% O2 37℃的培养箱中培养24 h。然后以FITC- Annexin V和PI双染法行流式细胞仪分析细胞的凋亡和死亡情况。结果:结论:AKT- MSCs在体外较MSCs更能耐受缺氧和乏营养所诱发的凋亡。第五部分猪骨髓MSCs自体移植治疗心肌梗死的实验研究目的在猪的心梗模型平台上,研究自体移植的转染AKT1的MSCs能否在体内较未转基因MSCs能更显著地改善缺血性心肌病的心脏功能,来探讨MSCs和基因联合应用治疗心肌缺血的可行性,以及研究干细胞治疗缺血性心肌病的机制。方法选用梅山小型猪(n=24),体重21～25㎏,应用明胶海绵栓塞LAD建立心梗模型。4周后行心脏磁共振检查,评估心功能;实验动物分成4组:空白组(A组,n=6)、DMEM组(B组,n=6)、MSCs组(C组,n=6)和转基因组(D组,n=6)。从每头猪的髂骨抽取骨髓30 mL,采用密度梯度离心与贴壁筛选相结合的方法分离纯化、体外扩增MSCs,D组MSCs体外转染AKT1基因。将BrdU标记的自体骨髓干细胞(1×107/5 mL)经心导管注射到LAD栓塞处远端。4周后,重复心脏磁共振检查,评估心功能和梗死区的灌注;并行心脏组织学研究,观察移植细胞的存活和分化情况。另外,采用ELISA法检测血浆VEGF、TGF-β1在梗死后和干细胞移植前后的变化。结果移植前,梗死心脏的左室舒张末径(EDLVd)增加,每搏量(SV)明显下降。移植后,C、D组的心功能较移植前有改善(P<0.05),移植的MSCs能防止梗塞区变薄和扩张;与A、B两组和移植前相比,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善(P<0.05),移植组的左室腔缩小(P<0.05);这种心功能的改善在D组更为明显(与C组比较,P<0.05)。与A、B两组相比,C、D组梗死区的毛细血管密度明显增加(P<0.05)。D组的增加比C组显著。VEGF的水平在梗死后有所增加,在细胞移植后一周出现高峰,后逐渐下降。结论MSCs能在宿主心肌组织中存活,通过防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常而改善左室功能;这种改善可能是MSCs通过心肌再生、血管再生和细胞外基质增生引起的。一些细胞因子在其中起非常重要的作用。AKT1的过表达可以使移植的干细胞更能耐受移植早期的缺氧和乏营养的微环境,减少细胞的凋亡,增加参与心肌修复的干细胞的绝对数量,从而可更加显著改善心脏功能。联合应用AKT1基因和MSCs自体移植是治疗缺血性心肌病的一种有效的方法。