淋巴瘤是血液科常见疾病,占每年新发肿瘤病例的5%,肿瘤死亡病例的3%。近30年来其发病率增高了2倍,导致这种情况的原因尚不明确。在所有的恶性淋巴瘤中非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)约占80%。多数NHL治疗效果较霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma,HL)差。联合化疗及美罗华等靶向治疗虽然可以使NHL生存期明显延长,但仍有部分患者复发、耐药并最终死亡。因此迫切需要对NHL发病机理进行更深入研究,以期发现更有效的治疗手段和措施。热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)广泛存在于多种细胞内,在热刺激、缺氧、创伤、氧化应激、药物等各种应激诱导下表达增加。通过参与细胞内蛋白质的折叠、伸展、转运和跨膜等过程HSPs发挥其“分子伴侣”功能,使细胞应对应激的能力增强。HSPs还具有抗凋亡的作用,它可以抑制凋亡通路中的多种蛋白,从而在凋亡通路的不同阶段阻断凋亡的发生。此外HSPs与肿瘤免疫也有密切的相关,研究表明HSPs能加强肿瘤的免疫原性,参与呈递肿瘤抗原,激发肿瘤免疫反应。由于在多种肿瘤细胞及组织中有高水平表达,并且与肿瘤发生、发展、生物学行为及预后有密切的关系,HSPs可以作为判断病情和预测预后的指标。部分研究还将HSPs作为肿瘤治疗的靶点。在体外实验中应用反义寡核苷酸或siRNA特异性抑制HSPs的表达,可以诱导肿瘤细胞凋亡和增强化疗敏感性。HSP90的抑制剂17-AAG在一期临床实验中显示了良好的疗效,目前已经进入二期临床实验。上述以HSPs为靶点的治疗为我们更好的治疗恶性疾病提供了新思路。在多数肿瘤中HSPs高表达是分期晚、治疗效果不佳和预后差的标志,但是HSPs在NHL中的相关表达通路及与疾病的生物学行为之间的关系目前仍不明确。本研究应用分子生物学技术探讨HSPs与淋巴瘤临床表现、恶性程度及治疗效果之间的相关性,并通过体外实验分析NHL Raji细胞中HSP70作用的相关通路和机理,希望对淋巴瘤的生物学特征有更深入的了解,为疾病的诊断和治疗服务。论文一PI3K/AKT通路在热处理诱导Raji细胞表达HSP70中的作用目的:热疗和化学治疗以及放射治疗联合可以用来治疗多种肿瘤。但是热疗的应用价值受到许多因素的影响,其中之一就是热休克反应。热休克反应是细胞内高度保守的分子应激反应,在这一过程中热休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)表达增加。而HSPs可以保护细胞免于一系列化学、物理和生物应激原的损伤。热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70,HSP70)是热休克蛋白家族最主要的成员之一。研究表明HSP70对凋亡有抑制作用,HSP70表达增加可以减少化疗药物及射线诱导的肿瘤细胞凋亡。因此热处理诱导的HSP70表达增高,可能会对抗肿瘤治疗产生不良影响。HSP70的表达主要受热休克因子1(Heat shock factor 1,HSFl)的调控。最新研究显示PI3K可以影响HSFl的活性,进而影响HSP70的表达。抑制PI3K/AKT通路后,细胞内HSP70表达降低。因此PI3K/AKT通路可能成为一个新的抑制HSP70表达的靶点。本研究利用LY294002(一种PI3K抑制剂)抑制PI3K/AKT通路,以探讨该通路在热处理诱导Raji细胞表达HSP70过程中的作用,并检测热处理诱导的HSP70表达对Raji细胞凋亡和化疗敏感性的影响。方法:根据细胞处理的不同方式,实验分为3组:1)对照组:Raji细胞不经过热处理,直接加用化疗药物作用;2)热处理组:Raji细胞首先经42℃热处理,随后在37℃培养4h,然后加入化疗药物作用;3)LY294002预处理后加热处理组:细胞首先经LY294002预处理,随后按照2组的方法处理。用Western blotting分析不同处理后HSP70,AKT和P-AKT的表达。用AnnexinV-PI双染来检测细胞凋亡率的变化。用WST-8法检测ADM和DDP对Raji细胞的毒性。结果:1 PI3K抑制剂抑制热处理诱导的HSPTO表达42℃热处理后2小时即有HSP70的表达增加。热处理后8小时,Raji细胞内HSP70表达达到最高峰。在加热处理后24小时,HSP70表达仍然高于对照组。热处理后4小时HSP70表达明显增加,同时伴有AKT活化(P＜0.05)。而如果在热处理前用LY294002预处理细胞,则HSP70表达及AKT活化明显减弱(P＜0.05)。2热处理使Raji细胞抵抗DDP诱导的细胞凋亡42℃热处理后24小时,Raji细胞凋亡率从6.44±0.64%上升到6.95±0.57%,差异无统计学意义(P＞0.05)。用5ug/ml和10ug/ml DDP单独处理Raji细胞24小时,分别诱导了14.1%±0.5%和16.9%±1.14%的凋亡率。而如果在热处理后应用DDP,则凋亡率下降到9.73%±0.28%和10.50%±0.85%(P＜0.01)。3 PI3K抑制剂可以抵消热处理对Raji细胞的保护作用热处理前分别应用10umol和20umol的LY294002来抑制HSP70的表达,观察细胞凋亡率的改变。与未用LY294002相比,应用LY294002后5ug/ml DDP诱导的凋亡率有了明显的升高。10umol和20umolLY294002分别将凋亡率从9.73%±0.28%提高到15.33%±0.45%和19.5%±0.75%,差异有统计学意义(P＜0.01)。4 PI3K抑制剂增强了热处理后Raji细胞对ADM和DDP的敏感性在经42℃加热预处理后,Raji细胞对ADM的敏感性明显下降,IC50从5.2ug/ml上升到17.0ug/ml。而如果在热处理前应用LY294002处理细胞,则可以显著增强ADM的敏感性,并且呈计量依赖性。10umol、20umol和40umolLY294002分别使ADM的IC50下降至10.6 ug/ml、8.8ug/ml和3.6ug/ml。应用DDP进行实验,趋势与上述结果一致。结论:1.本研究首次证实在热诱导的Raji细胞内存在PI3K/AKT/HSP70表达通路。PI3K抑制剂LY294002可以抑制热处理诱导的HSP70表达。本研究为抑制Raji细胞中热诱导的HSP70表达提供了新思路。2.适当温度的热处理对Raji细胞有保护作用。当热处理诱导的HSP70表达被抑制后,该保护作用减弱甚至消失。因此热处理对Raji细胞的保护作用可能是通过诱导HSP70表达来实现的。论文二热休克蛋白70、90α在非霍奇金淋巴瘤中的表达及临床意义目的:HSP70和HSP90是热休克蛋白家族中两个最重要同时也是研究最深入的成员。多种肿瘤组织中有HSP70和HSP90的表达,并且与肿瘤的分期和预后相关。但是在不同肿瘤中HSP70和HSP90所体现的意义不尽相同,部分研究的结果甚至是相互矛盾的。这可能与肿瘤的特异性有关。有研究表明在淋巴瘤细胞中有HSP70和HSP90表达,但未能明确两者表达与淋巴瘤临床表现和治疗效果的关系。我们通过免疫组织化学技术检测两种热休克蛋白HSP70和HSP90α在NHL、坏死性淋巴结炎和淋巴结反应性增生组织中的表达并探讨其意义。方法:选取资料完整的NHL病例30例;年龄6～84岁,平均年龄43.6岁。所有标本均经两位病理学专家重新阅片证实。按Ann Arbor分期法对NHL进行分期。参照美国国立癌症研究所工作分型(1982年)进行病理分型。10例坏死性淋巴结炎和12例淋巴结反应性增生组织作为对照。用免疫组化法检测HSP70和HSP90α在三种组织中的表达。HSP70及HSP90α均以细胞核或胞浆黄染为阳性。计算阳性细胞百分数:≤5%为(-),6～25%为(+),26～50%为(++),＞50%为(+++);(+++)为高表达。结果:HSP70、90α均表达于NHL细胞胞浆和胞核。在NHL、坏死性淋巴结炎和淋巴结反应性增生组织中两种热休克蛋白均有高水平的表达,但差异无统计学意义(P＞0.05)。HSP70和HSP90α阳性表达与NHL恶性程度,分期,有无B症状,是否累计结外及治疗效果均无相关性(P＞0.05)。HSP70高表达(阳性率大于50%)与NHL恶性程度,分期及治疗效果密切相关(P＜0.05),与是否有B症状、是否累及结外无关(P＞0.05)。HSP90α高表达与上述指标无相关性(P＞0.05)。结论:1.本研究首次应用免疫组化技术检测了HSP70在NHL中表达情况,并证实在NHL组织中HSP70的高表达率与NHL恶性程度、分期及治疗效果相关。因此HSP70可以作为判断NHL病情和治疗效果的指标。2.首次明确了国内NHL患者亦有高水平HSP90α表达,但是HSP90α表达与NHL恶性程度、分期、B症状、节外浸润及治疗效果无相关性。3.HSP70及HSP90α在NHL中均有高水平表达,为在NHL中开展针对性靶向治疗提供了理论依据。