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目的同型半胱氨酸(Hcy)被认为是导致动脉粥样硬化(AS)的独立危险因素,血液中大量的Hcy蓄积会导致血脂紊乱、内皮功能障碍和血管炎症,并通过内质网应激反应(ERS)直接损伤血管,导致AS发生。更年期女性由于内源性雌激素的缺乏,心脑血管疾病发病率进一步提高。前期研究中,我们发现六味地黄方可以通过雌激素受体发挥抗AS的作用。本实验结合前期研究成果,利用雌性ApoE-/-小鼠建立更年期AS模型,从同型半胱氨酸、血脂、内皮细胞功能、炎性因子等角度评价六味地黄方对该模型的影响,并利用Hcy建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型,评价六味地黄方对内皮细胞的保护作用。探索六味地黄方对AS过程中内质网应激的影响,并从雌激素受体GPR30的角度探讨六味地黄方抗AS作用的可能机制。方法1健康雌性ApoE-/-和C57BL/6小鼠,C57组选用C57BL/6小鼠切除双侧卵巢下方少量脂肪,ApoE-/-对照组切除双侧卵巢,以上两种喂养SPF级实验鼠颗粒饲料饲养。余下的ApoE-/-小鼠切除双侧卵巢,高脂饲料喂养30天后,将TC>7.8mmol/L的模型小鼠随机分为以下四组:模型组,戊酸雌二醇组(1.3×10-4g/kg),辛伐他汀组(4.3×10-3g/kg),六味地黄方(质谱检测其中主要成分)组(9.75g/kg),以上三组灌胃给药,每天1次,剩余小鼠每天灌胃给予等容积的生理盐水,共90天。每周称量小鼠体重与摄食量,根据体重调整给药量,每30天取血检测血浆中TC值。给药90天后,取血检测血浆中脂质(TC,TG,HDL,LDL)、CRP、TNF-α、IL-1β、IL-10、NO、eNOS、iNOS 和 Hcy 的表达。油红染色观察AS斑块面积,HE染色、透射电镜观察主动脉形态学变化,Westen blot和免疫组化法检测内质网应激蛋白Grp78与CHOP的表达,以及六味地黄方对雌激素受体GPR30的影响。2采用80mmol/L同型半胱氨酸建立HUVECs损伤模型,观察六味地黄方含药血清对HUVECs的保护作用。模型复制成功后,MTT法检测细胞存活情况,Hoechst染色观察细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞凋亡率。Westen blot和免疫荧光法检测雌激素受体GPR30的表达,同时检测六味地黄方对内质网应激蛋白Grp78和CHOP的影响。采用25umol/L G15(GPR30特异性阻断剂)在HUVECs上阻断雌激素受体GPR30后,Westen blot和免疫荧光法检测六味地黄方含药血清对内质网应激蛋白Grp78与CHOP的影响是否发生变化。结果1六味地黄方对雌性ApoE-/-小鼠更年期AS模型的影响1.1六味地黄方对雌性ApoE-/-小鼠更年期AS模型血脂的影响:ApoE-/-对照组小鼠血浆TC、TG、LDL-C和HDL-C水平明显升高,模型组各项指标进一步升高,给药90天后,各给药均可显著降低TC、TG和LDL-C的含量,升高HDL-C的含量。六味地黄方改善血脂的作用要优于雌二醇组,与辛伐他汀基本无差异。1.2六味地黄方对ApoE-/-小鼠更年期AS模型主动脉病理变化的影响油红染色发现C57组主动脉弓处基本没有斑块形成,ApoE-/-对照组有少量斑块形成,模型组小鼠主动脉弓处斑块形成密集,堵塞血管;各给药组均能不同程度降低AS斑块的形成,六味地黄方组效果较其他两组更为明显。HE染色可见ApoE-/-对照组小鼠仅仅出现中膜脂质沉着和血管中膜变薄这两种病理现象,血管出现轻度损伤,模型组小鼠血管出现AS典型的斑块、血管钙化、纤维帽等病理现象。各给药组均能不同程度降低血管损伤程度,其中六味地黄方和辛伐他汀都能显著降低血管钙化程度、血管壁AS斑块面积以及纤维帽数量,明显减缓AS病变进程。1.3六味地黄方对ApoE-/-小鼠更年期AS模型NO和NOS的影响:ApoE-/-对照组小鼠血浆中NO和eNOS含量降低,iNOS含量升高,模型组小鼠各指标变化更加明显,不同给药组均可以升高血浆中NO和eNOS含量,降低iNOS含量,六味地黄方升高eNOS表达的作用优于雌二醇组和辛伐他汀组。1.4六味地黄方对ApoE-/-小鼠更年期AS模型炎性因子的影响:ApoE-/-对照组小鼠CRP、TNF-α和IL-1β升高,喂养高脂后模型组小鼠上述指标进一步升高,炎症反应加剧,各给药组能不同程度的降低血浆中CRP、TNF-α和IL-1β的含量,并且升高IL-10的含量,有明显的抗炎作用,六味地黄方对各炎性指标的作用都要优于其他两个给药组,显示了其更优秀的抗炎作用。1.5六味地黄方对ApoE-/-小鼠更年期AS模型Hcy的影响:ApoE-/-对照组小鼠血浆Hcy含量显著升高,模型组小鼠血浆中Hcy含量进一步升高,各给药组均能降低Hcy的含量,但是无法恢复到正常水平。1.6六味地黄方对ApoE-/-小鼠更年期AS模型内质网应激蛋白Grp78、CHOP和雌激素受体GPR30的影响:Western blot结果显示ApoE-/-对照组小鼠主动脉内质网应激蛋白Grp78与CHOP表达升高,模型组小鼠主动脉两蛋白的表达进一步增多,表明内质网应激反应产生:雌激素组与辛伐他汀组降低Grp78与CHOP的表达,六味地黄方组进一步升高了 Grp78的表达,同时降低了 CHOP的表达。Wester blot结果显示ApoE-/-对照组小鼠主动脉雌激素受体GPR30表达下降,高脂喂养后,模型组小鼠GPR30表达进一步下降,各给药组均能不同程度升高GPR30的表达,除戊酸雌二醇组以外其他各给药组GPR30的表达均没有超过正常水平。免疫组化结果与Western blot结果一致。2六味地黄方对Hcy致内皮细胞损伤模型的影响2.1 MTT结果显示在80mmol/L时Hcy对HUVECs的损伤率达到50%左右,给予20%含药血清之后,药物对HUVECs的保护率约为99.97%。2.2 Hoechst染色:Hcy作用后荧光染料颜色较对照组明显变亮,呈典型的凋亡形态学变化,细胞数量也明显减少。加入六味地黄方含药血清后可显著改善Hcy诱导的细胞凋亡形态,细胞数量也明显增加。2.3 Annexin V-FITC/PI染色:Hcy作用24h后,凋亡率显著升高,给药组加入20%六味地黄方含药血清后,与模型组相比,凋亡明显下降。2.4六味地黄方含药血清对内质网应激蛋白和雌激素受体GPR30的影响:wester blot与免疫荧光结果显示,给予80mmol/LHcy后,HUVECs上内质网应激蛋白Grp78与CHOP的表达升高,给予20%六味地黄方含药血清后,Grp78的表达进一步的升高,CHOP的表达则显著降低。wester blot与免疫荧光结果显示,Hcy作用24h后,GPR30的表达明显下降,给予20%六味地黄方含药血清后,GPR30的表达上调,但是未超过正常水平。与前期整体动物实验结果一致。2.5雌激素受体GPR30介导的六味地黄方对内质网应激蛋白Grp78和CHOP的影响:western blot结果显示,在给予80mmol/L Hcy作用24h后,内质网应激蛋白Grp78与CHOP的表达上调,六味地黄方含药血清可以进一步升高Grp78的表达,并降低CHOP的表达,缓解内质网应激反应;在使用25μmol/L的G15阻断GPR30受体同时给予Hcy作用24h后,两种蛋白的表达情况与单独使用Hcy一致,但是给予六味地黄方含药血清后,不能改变蛋白表达,无法缓解内质网应激反应;免疫荧光结果与western blot结果一致。结论1六味地黄方对去势雌性ApoE-/-小鼠AS模型有着良好的治疗作用,可以通过影响同型半胱氨酸、血脂、炎性因子、内皮功能达到抗AS的作用。2六味地黄方可以显著的抑制内皮细胞凋亡,缓解AS的发生。3六味地黄方可以通过改善内质网应激蛋白Grp78与CHOP的表达,缓解内质网应激反应,以达到保护主动脉血管的目的。4六味地黄方通过影响内质网应激反应保护内皮细胞,缓解AS发生的作用是通过雌激素受体GPR30实现的。