【摘 要】
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抗生素滥用导致临床中的致病菌出现不同程度耐药,粪肠球菌（Enterococcus faecalis,简称E.faecalis）作为一种革兰氏阳性菌,是引起医院大规模感染的常见病原体,在宿主内易位寄生引发脑膜炎、败血症和心内膜炎等疾病。因为对大分子物质有较低的通透性、较厚的细胞壁以及能获取抗性基因等因素,临床出现了抵抗不同抗生素的粪肠球菌菌株,其中万古霉素被认为是治疗革兰氏阳性菌的最后一道防线,但也
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抗生素滥用导致临床中的致病菌出现不同程度耐药,粪肠球菌（Enterococcus faecalis,简称E.faecalis）作为一种革兰氏阳性菌,是引起医院大规模感染的常见病原体,在宿主内易位寄生引发脑膜炎、败血症和心内膜炎等疾病。因为对大分子物质有较低的通透性、较厚的细胞壁以及能获取抗性基因等因素,临床出现了抵抗不同抗生素的粪肠球菌菌株,其中万古霉素被认为是治疗革兰氏阳性菌的最后一道防线,但也鉴定出耐万古霉素的菌株,所以寻求新的治疗方法成为当务之急。噬菌体作为细菌的天敌成为首选,可是噬菌体以活病毒的方式入侵宿主使得开发成为困难。但在噬菌体裂解细菌后期分泌一类对细菌细胞壁的主要成分肽聚糖起切割作用的裂解酶（lysin）,其本质是蛋白质,相对于噬菌体来说,裂解酶具有更好的可控性、更高的特异性和更强的裂解能力,因此成为了研究的热点。噬菌体裂解酶的结构一般由N端的催化结构域（catalytic domain,CD）以及C端的细胞壁结合结构域（cell binding domain,CBD）组成,两者通过Linker连接。来自噬菌体F170/08的Lys170是早期发现的裂解酶之一,能裂解粪肠球菌,但裂解的特异性菌株以及裂解机理都是未知,因此我们通过生物化学手段、使用结构生物学方法解决这一问题。本论文首先选用大肠杆菌表达系统对Lys170进行表达与纯化,然后对临床分离出的致病菌进行筛选找到对粪肠球菌40号菌株有高效的裂解能力;同时使用X射线晶体学方法解析1.40?分辨率的蛋白结构,可能由于Linker区域柔性导致最后电子密度图只有C端的Lys170 CBD（氨基酸202-289）;结构分析表明Lys170 CBD以四聚体状态存在溶液中,每个单体以三个连续的β折叠为中心,两侧各覆盖一个α螺旋的形式组成;将四聚体结合的七个氨基酸位点进行突变分析,表明Y203完全破坏Lys170 CBD的四聚体界面并丧失杀菌能力,说明Lys170 CBD四聚体的形成对全酶发挥裂解能力至关重要;考虑到Lys170 CBD结合细胞壁,对结构进行表面带电性分析并突变了六个可能参与结合细胞壁的带正电荷的氨基酸位点,使用平板滴定实验鉴定出R235、R236两个位点对于结合粪肠球菌的细胞壁很重要。综上所述,本论文对Lys170的结构和功能探索,帮助了解其裂解机制,为后续抗菌药物研发提供理论基础。
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