目的:人血清中期因子(midkine,MDK)在多种恶性肿瘤中呈高表达,通常扮演癌基因的角色,参与肿瘤生长、迁移等生物学行为。MDK在甲状腺癌的功能及机制中研究报道较少,本文通过建立过表达和敲除MDK的甲状腺癌稳定细胞系,旨在探讨MDK对不同分化类型甲状腺癌及其淋巴管内皮细胞增殖和迁移功能的影响,并进一步研究其背后的分子机制。方法:第一部分:收集6对甲状腺癌病人组织,应用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测6对癌组织及对应癌旁组织中MDK蛋白的表达情况;与此同时,培养正常甲状腺细胞(NTHY)及甲状腺癌细胞(K1,TPC1,THJ16T,BCPAP,ARO,T238),WB检测MDK细胞内的表达水平;酶联免疫吸附(Elisa)检测MDK细胞外的表达水平。第二部分:根据MDK的细胞外表达水平,在乳头状癌细胞系中,选取高表达的K1、BCPAP细胞。未分化癌细胞系中,选取THJ16T细胞。运用Crisp-cas9技术构建稳定敲除MDK稳定细胞系,下调MDK表达。进一步运用WB从蛋白水平验证稳系构建效果。第三部分:根据MDK的细胞外表达水平,在乳头状癌细胞系中,选取表达低水平的TPC1细胞。在未分化癌细胞系中,选取THJ16T细胞。构建慢病毒稳定过表达MDK稳定细胞系,上调MDK表达。运用WB及Elisa从细胞内、外蛋白表达水平验证稳系构建效果。第四部分:探讨MDK对甲状腺癌细胞增殖及迁移功能的影响。运用(Cell Counting Kit-8,cck8)及克隆形成实验分析增殖表型;Trans-well和划痕实验分析迁移表型。进一步通过WB检测增殖及迁移相关蛋白分子的变化。第五部分:探讨MDK蛋白表达对淋巴管内皮细胞增殖、迁移行为的影响。选取过表达MDK的稳系细胞,应用共孵实验分析淋巴管内皮细胞的增殖及迁移表型。结果:第一部分:MDK在人甲状腺癌组织中呈高表达,在癌旁组织中低表达甚至不表达。与临床表达情况相似,与正常甲状腺上皮细胞相比,甲状腺癌细胞中MDK呈高表达。第二部分:通过质粒构建、慢病毒感染,成功构建MDK敲除稳定细胞系K1-MDK-KO、BCPAP-MDK-KO、THJ16T-MDK-KO,与对应转染空质粒的稳系细胞比较,敲除组细胞的MDK细胞内及细胞外蛋白明显下调。第三部分:通过MDK过表达质粒构建、慢病毒感染,构建MDK过表达稳定细胞系TPC1-MDK-OVER、THJ16T-MDK-OVER,与对应转染空质粒的稳系细胞比较,过表达组细胞的MDK细胞内及细胞外蛋白明显上调。第四部分:MDK选择性影响甲状腺癌细胞系的增殖能力。体外实验表明:甲状腺乳头状癌细胞系中稳定敲除/过表达MDK蛋白后,细胞增殖能力无明显变化,但是在未分化癌中,细胞增殖明显变慢/变快。WB发现抗凋亡蛋白Bcl2上调,凋亡蛋白Bax下调。MDK选择性影响甲状腺癌细胞系的迁移能力。体外实验表明:甲状腺癌乳头状癌细胞系中稳定敲除/过表达MDK蛋白后,细胞迁移能力无明显变化,但是在未分化癌中,细胞迁移能力明显减弱/增强。在表型发生变化的未分化癌细胞系中,WB发现迁移蛋白vmintin、snail、N-ca明显上调,同时部分迁移蛋白β-catenin、twist出现轻微下调。第五部分:甲状腺未分化癌细胞系分泌MDK影响淋巴管内皮细胞增殖和迁移。对于淋巴管内皮细胞,体外共孵实验表明:甲状腺癌未分化癌细胞系中稳定过表达MDK蛋白后,淋巴管内皮细胞增殖、迁移能力增强。结论:MDK在甲状腺癌组织和细胞系中高表达。在乳头状癌细胞系中,MDK的表达对增殖及迁移能力无明显影响;未分化癌细胞系中,MDK通过影响增殖和迁移相关蛋白分子,促进增殖及迁移。未分化癌细胞系分泌的MDK促进淋巴管内皮细胞的增殖、迁移。