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背景金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal Enterotoxins,SEs)是一类具有较强超抗原活性的蛋白。SEs作为典型的超抗原,在临床上具有显著的抗肿瘤活性,但其所引起的发热及致呕吐毒性等副作用严重限制了其在恶性肿瘤生物治疗中的广泛应用。而金黄色葡萄球菌类肠毒素(Staphylococcal Enterotoxin-like,SEls)的发现为肿瘤的免疫治疗提供了潜在的候选生物制剂,其具有与SEs相似的结构及其超抗原活性,但无致呕吐毒性或仅具有较低的呕吐毒性。目的1.构建金黄色葡萄球菌类肠毒素Q(SElQ)的原核表达载体。2.探讨SElQ对小鼠脾淋巴细胞以及人外周血单核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)活化的影响。3.检测SElQ的体内外抗肿瘤活性。方法1.通过PCR技术克隆获得selq基因,双酶切后连接至pET28a原核表达载体,转化E.coli DH5α菌株后进行菌落PCR及质粒双酶切验证,随后转化E.coli BL21菌株进行诱导表达。通过BeaverBeads?IDA-Nickel试剂盒纯化SElQ蛋白。2.MTT法检测SElQ对小鼠脾淋巴细胞和人PBMCs的活化作用;流式细胞术检测SElQ对小鼠脾脏CD4~+和CD8~+T淋巴细胞增殖的影响。3.ELISA法分别检测经SElQ作用后小鼠体内外,以及人PBMCs上清液中细胞因子IL-2和IFN-γ的表达水平。4.qPCR体外检测经SElQ刺激48 h后小鼠脾淋巴细胞中IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、GA和GB以及人PBMCs中具有特异性TCR Vβ的T淋巴细胞增殖变化。5.MTT法检测SElQ所激活的人PBMCs对人乳腺癌肿瘤细胞BT474及人肺癌肿瘤细胞A431增殖的影响,明确SElQ的体外抗肿瘤活性;随后通过非接触式共培养检测SElQ激活的人PBMCs所分泌的活性因子对A431活性的影响;进一步通过活细胞工作站观察SElQ激活的人PBMCs对A431肿瘤细胞的直接杀伤作用。6.成功制备小鼠肿瘤模型后,尾静脉注射SElQ,在实验周期结束时处死小鼠,分离肿瘤组织、脾脏及肝脏拍照并称重。通过肿瘤抑制率来检测SElQ的体内抗肿瘤活性,其次通过计算分析BWVI、MFC、SI及LI等相关指标初步验证SElQ潜在的毒副作用。结果1.本实验成功构建pET28a-SElQ原核表达载体,诱导表达后通过磁珠纯化获得高纯度带有his标签的SElQ蛋白。2.MTT结果显示SElQ能够显著刺激小鼠脾淋巴细胞和人PBMCs的增殖;流式细胞术检测结果发现SElQ可显著增加小鼠脾脏CD4~+和CD8~+T淋巴细胞的百分比和绝对数量。3.ELISA结果表明经不同浓度SElQ刺激后,IL-2和IFN-γ的表达水平在体外和体内均显著上调。qPCR结果进一步发现SElQ可显著促进小鼠脾淋巴细胞中IL-4、IL-6、IL-10、GA和GB的基因表达。此外,不同浓度SElQ刺激的人PBMCs上清中IL-2和IFN-γ分泌水平亦显著增加。4.qPCR结果表明SElQ能够激活携带有TCR Vβ5、Vβ14、Vβ17、Vβ18和Vβ21的T淋巴细胞,尤其是携带有TCR Vβ5的T淋巴细胞。5.SElQ在体内外均展示出明显的抗肿瘤活性,低浓度SElQ尾静脉注射可显著抑制肿瘤生长,抑瘤率约为30%,且未发现明显副作用。结论SElQ能够通过活化T淋巴细胞,促进细胞因子分泌,发挥其抗肿瘤活性。