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目的:血栓形成是涉及临床多种疾病的重要病理生理过程,在心血管疾病领域,特别是在动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等疾病的发生发展过程中,起着非常重要的作用,常可引起严重危害人类健康的临床综合征。在血栓形成过程中,一方面血小板可以通过释放多种细胞因子及其类似物促进炎症进展,同时也可通过凝血因子相继酶解激活,瀑布式放大凝血过程,促进血栓形成。因此探讨血小板活化的机制及其影响因素,一直是心血管病研究领域的重点和热点。已有研究发现,血脂升高特别是低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)水平增高与血小板活化密切相关。羟甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxymethyl-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-Co A)还原酶抑制剂(简称他汀类药物)是目前临床常用的调脂药,可通过抑制体内胆固醇合成步骤中的限速酶(HMG-Co A还原酶),在调节脂质代谢过程。多项研究证实,他汀类药物具有多种疗效显著的抗动脉粥样硬化作用,其中包括抗血小板作用。近年研究发现,他汀类药物,特别是脂溶性他汀,如辛伐他汀等,可直接影响血小板功能,抑制血小板激活,并且可独立于其降低胆固醇水平之外发挥上述作用,然而,所涉及的相关机制尚不十分明确。过氧化物酶体增值物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)属于核受体超家族,研究已经证实PPARs激活后通过调节脂代谢,脂肪酸氧化及糖代谢平衡等多种机制发挥抗炎、延缓动脉粥样硬化进展等作用。而他汀类药物可作为PPARs的配体,通过激活PPARs,参与调节多种病理生理过程。血小板虽然是无核细胞,但研究发现,在血小板胞浆中三种PPARs亚型(PPARα,PPARβ,PPARγ)均有表达,并可通过非基因调控途径影响血小板功能,然而,具体的机制尚不清楚。目前研究证实,多种诱导剂(如胶原,ADP,花生四烯酸等)可快速激活血小板。当血小板活化后,在其表面表达多种血小板膜糖蛋白(如可溶性P-选择素,即CD62P;CD40L;CD63等),这些糖蛋白大多存在于静息血小板胞浆颗粒膜上,当血小板活化后,分泌胞浆颗粒,颗粒膜与质膜融合,进而表达于血小板表面;此外,血小板活化也可使其原有跨膜糖蛋白发生构象改变(如GPⅡb/Ⅲa),从而促进血小板粘附聚集。此外血小板激活后,可引起胞浆内钙离子浓度([Ca2+]i)升高及环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)生成减少,这些都可以反应血小板活化状态。文献报道,血小板胞浆c AMP水平升高可通过多种机制抑制血小板功能,PI3K/Akt及血小板丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号系统激活与c AMP水平密切相关。因此,本研究通过探讨辛伐他汀体外干预对胶原诱导的血小板聚集粘附,对血小板活化标志物表达、胞浆内钙离子浓度变化、血小板胞浆c AMP水平、所涉及的PI3K/Akt及血小板MAPKs信号系统的影响,以及血小板胞浆PPARs活化对上述影响的作用,力求从新的角度阐述他汀类药物抗血小板活化的作用机制。方法:本研究首先应用全血阻抗法探讨辛伐他汀对胶原诱导的血小板聚集的作用,并通过ELISA法检测辛伐他汀对血小板PPARs活化的影响,随后应用全血阻抗法和激光共聚焦技术探讨PPARs活化对辛伐他汀抑制血小板聚集及粘附的影响。此外,利用流式细胞术、分光光度法、ELISA法等进一步证实辛伐他汀具有抑制胶原诱导的血小板活化的作用,同时PPARγ激活在辛伐他汀抑制血小板活化中发挥重要作用。通过应用蛋白免疫印迹、免疫共沉淀技术进一步探讨辛伐他汀影响胶原诱导的血小板活化所涉及的信号转导通路,以及PPARγ激活对相关信号传导通路的影响及作用方式。本研究旨在揭示辛伐他汀对胶原诱导的血小板活化的影响,及PPARs活化的作用,为了解辛伐他汀的抗血小板作用提供新的理论依据。结果:我们的研究发现,辛伐他汀体外孵育血小板可激活PPARα及PPARγ,对PPARβ无明显活化作用。同时,随着药物浓度升高,及孵育时间延长,辛伐他汀可呈浓度和时间依赖性的抑制血小板聚集。当应用PPARα及PPARγ拮抗剂(GW6471,GW9662,终浓度均为10μmol/L)预孵育全血样本时,结果显示,虽然辛伐他汀具有PPARα及PPARγ双重激活作用,但是只有PPARγ拮抗剂(GW9662)可以逆转辛伐他汀对胶原诱导的血小板聚集的抑制作用,拮抗PPARα虽有逆转趋势,但是无统计学意义。通过采用共聚焦显微镜观察血小板粘附功能,也得到类似的结论,证实辛伐他汀可以通过PPARs激活,发挥抑制血小板粘附的作用,并且,PPARγ活化在其中起主要作用。进一步的研究发现,辛伐他汀体外孵育可呈剂量相关性抑制胶原诱导的血小板CD62p表达升高(10μmol/L辛伐他汀组49.9%±4.21,30μmol/L辛伐他汀组26.8%±2.89 v.s.阳性对照组74.6%±4.25,P<0.05),以及血小板PAC-1表达升高(10μmol/L辛伐他汀组55.6%±6.01,30μmol/L辛伐他汀组35.3%±4.85 v.s.阳性对照组85.2%±4.16,P<0.05)。当联合PPARs拮抗剂孵育,PPARγ拮抗剂(GW9662)可显著逆转不同浓度辛伐他汀对血小板CD62p表达的抑制作用(10μmol/L辛伐他汀联合GW9662组62.3%±3.41 v.s.10μmol/L辛伐他汀组49.9%±4.21 P<0.05,30μmol/L辛伐他汀联合GW9662组37.8%±2.59 v.s.30μmol/L辛伐他汀组26.8%±2.89,P<0.05),及对血小板PAC-1表达的抑制作用(10μmol/L辛伐他汀联合GW9662组74.5%±5.68 v.s.10μmol/L辛伐他汀组55.6%±6.01 P<0.05,30μmol/L辛伐他汀联合GW9662组47.9%±3.85 v.s.30μmol/L辛伐他汀组35.3%±4.85,P<0.05),而PPARα拮抗剂(GW6471)未观察到明显的逆转作用。类似的结果也反映在血小板胞浆钙离子浓度变化上,我们的研究发现,辛伐他汀体外孵育可呈剂量相关性抑制胶原诱导的血小板胞浆[Ca2+]i升高(3μmol/L辛伐他汀组981±35.62 nmol/L,30μmol/L辛伐他汀组654±43.54 nmol/L,50μmol/L辛伐他汀组392±30.55 nmol/L v.s.阳性对照组1287±50.1 nmol/L,P<0.05)。同时,当联合PPARs拮抗剂孵育,结果显示,PPARγ拮抗剂(GW9662)可显著逆转不同浓度辛伐他汀对血小板胞浆[Ca2+]i升高的抑制作用(3μmol/L辛伐他汀联合GW9662组1159±38.62 nmol/L v.s.3μmol/L辛伐他汀组981±35.62 nmol/L P<0.05,30μmol/L辛伐他汀联合GW9662组989±37.55 nmol/L v.s.30μmol/L辛伐他汀组654±43.54 nmol/L P<0.05,50μmol/L辛伐他汀联合GW9662组555±37.2 nmol/L v.s.50μmol/L辛伐他汀组392±30.55 nmol/L,P<0.05),而PPARα拮抗剂(GW6471)未观察到明显的逆转作用。通过对血小板c AMP水平及VASP-Ser157磷酸化的研究也证实,不同浓度辛伐他汀体外孵育可显著增加血小板c AMP水平(3μmol/L辛伐他汀组9.5±0.36 pmol/m L,30μmol/L辛伐他汀组22.4±0.72 pmol/m L,50μmol/L辛伐他汀组30.5±0.64 pmol/m L v.s.阳性对照组5.2±0.58pmol/m L,P<0.05)。而血小板胞浆c AMP是抑制血小板活化的重要因素。同时,血小板c AMP升高可引起VASP Ser 157磷酸化,而辛伐他汀体外孵育可呈剂量依赖性促进VASP Ser 157磷酸化,这与其升高血小板c AMP水平作用一致。当联合PPARs拮抗剂孵育,结果显示,PPARγ拮抗剂(GW9662)可显著逆转不同浓度辛伐他汀对血小板c AMP的升高作用(3μmol/L辛伐他汀联合GW9662组7.1±0.54 pmol/m L v.s.3μmol/L辛伐他汀组9.5±0.36 pmol/m L P<0.05,30μmol/L辛伐他汀联合GW9662组15.4±0.68 pmol/m L v.s.30μmol/L辛伐他汀组22.4±0.72 pmol/m L P<0.05,50μmol/L辛伐他汀联合GW9662组21.5±0.71 pmol/m L v.s.50μmol/L辛伐他汀组30.5±0.64 pmol/m L,P<0.05),而PPARα拮抗剂(GW6471)未观察到明显的逆转作用。与之一致的,当联合GW9662拮抗共同孵育,结果表面,拮抗PPARγ活性,可逆转辛伐他汀对血小板VASP Ser157磷酸化的抑制作用。通过对相关信号传导通路的研究发现,辛伐他汀体外孵育可呈剂量依赖性抑制胶原诱导的血小板胞浆Akt磷酸化,而后者可进一步调控血小板聚集、分泌等多种反应。当联合PPARγ拮抗剂GW9662与辛伐他汀共同孵育,可显著逆转后者对胶原诱导的血小板Akt磷酸化的抑制作用。此外丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号传导通路在血小板活化中具有重要作用,血小板c AMP水平变化及Akt磷酸化与MAPKs信号传导通路(ERK1/2,p38 MAPK,JNK)活化密切相关。我们的研究发现,辛伐他汀可呈剂量依赖性抑制胶原诱导的血小板p38 MAPK及ERK1/2磷酸化,而对JNK磷酸化无明显影响。联合PPARγ拮抗剂(GW9662)与辛伐他汀共同孵育,可逆转辛伐他汀对胶原诱导的血小板p38 MAPK及ERK1/2磷酸化的抑制作用。更进一步的,通过免疫共沉淀的方法证明,辛伐他汀可呈剂量依赖性的增加胶原诱导的血小板胞浆PPARγ与p38 MAPK及ERK1/2的结合,结果表明,辛伐他汀可通过PPARγ与MAPKs(p38 MAPK,ERK1/2)信号通路产生直接相互作用,并可通过此种作用影响MAPK通路(p38MAPK及ERK1/2)磷酸化。结论：1辛伐他汀具有PPARα及PPAR双重激活作用,并可呈时间及剂量依赖性抑制胶原诱导的血小板聚集和粘附,PPARγ活化在其中发挥重要作用。2辛伐他汀主要通过PPARγ活化抑制胶原诱导的血小板活化标志物P-选择素及PAC-1表达,并抑制血小板胞浆[Ca2+]i浓度升高,同时可通过PPARγ活化促进血小板c AMP水平及VASP Ser157磷酸化。3辛伐他汀可通过PPARγ活化抑制胶原诱导的血小板Akt磷酸化,及MAPKs(p38 MAPK,ERK1/2)信号传导通路磷酸化,并且通过PPARγ与p38 MAPK及ERK1/2的直接作用发挥抑制作用,进而影响血小板功能。