本课题通过溶剂热法合成一种新型的金属有机框架材料1,并利用不同方法对载体材料进行结构表征,进而将抗癌药物5-Fu加载到金属有机框架材料1中,观察其体外释药性能,以及在体外细胞实验中对金属有机框架材料1的毒性进行评估,分析其是否有具有较高的载药量,稳定性及生物相容性如何,能否成为一种较为理想的药物载体在临床治疗中予以应用。第一部分Gd(Ⅲ)-MOF的制备及表征目的:本研究将利用金属-有机框架材料装载5氟尿嘧啶(5-Fluorouraci,5-Fu)药物,并对其进行药物释放测试和药物加载测试,并在体外对加载药物后的金属-有机框架材料的外释药特性进行观察,研究新研制的载药MOF的生物相容性。材料与方法:将金属中心设定为轧(Gd)离子,以4,4’,4"-苯羰基三苯甲酸(4,4’,4”-benzenetricarbonyltribenzoic acid,H3BCB)为有机配体,采用溶剂热法合成了一种新型的Gd(Ⅲ)金属-有机框架1,这种新型的金属-有机框架化学式为[Gd(BCB)(DMF)](H20)2,产率为 47%(基于 GdN036H20)。对 Gd(Ⅲ)金属-有机框架1进行表征主要从元素分析、傅里叶红外光谱(Fourier Transform Infrared,FT-IR)、X射线单晶衍射分析、巨正则蒙特卡罗模拟(Grand canonical Monte Carlo simulation,GCMC)方面着手。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法评估1a的生物相容性,观察四种浓度20 μg/mL、40 μg/mL、100 μg/mL、200μg/mL的化合物1a对细胞株BEL-7404(肝癌细胞)和口腔表皮细胞(正常细胞)的细胞毒性。结果:1对Gd(Ⅲ)金属-有机框架1进行X射线单晶衍射分析,结果表明Gd(Ⅲ)金属-有机框架1属于Fdd2空间群,晶体结构为正交晶系,且具有不对称的晶体构筑单元,两个游离水分子、两个BCB3-阴离子(完全去质子化)、两个独立的Gd3+离子、两个DMF配体(末端配位)共同构建了 Gd(Ⅲ)金属-有机框架1晶体构筑单元。Gd1中心含8个配位的氧原子,其中2个来自末端配位的DMF分子,而剩下6个氧原子来源于不同的BCB3-配体。同时,Gd2中心也是由8个氧原子配位,但是与Gd1不同的是,这8个氧原子来自六种不同BCB3-配体。对所得结构进行元素分析,结果为C33H26GdN012,理论计算值:C,50.44;H,3.34;N,1.78%;实验值:C,50.16;H,3.13;N,1.92%。FT-IR(KBr,cm-1):3123(br),1947(w),1773(w),1712(w),1610(vs),1549(s),1381(vs),1163(w),1109(m),1019(m),832(w),771(w),741(m),705(w),579(w)。2 FT-IR结果显示化合物1沿C轴的1D通道大小为13.7 × 6.4 A2,其大小足以容纳抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)分子。在冲入氮气后,将温度调整在30℃-800℃范围内,对化合物1进行热稳定性分析,利用热重分析方法确定化合物1的热稳定性。化合物1在30℃至250℃范围发生第一次热失重,失重14%(理论值:13.9%),推测晶体中的两个晶格水分子和一个配位DMF分子丢失。将温度调整至500℃时,发生结构坍塌。热重分析结果显示其具有较高的热稳定性。将化合物1在37℃条件下,浸泡在磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffer saline,PBS(pH=7.4和6.5))中1天,来检查化合物1在PBS溶液中的稳定性。结果显示化合物1能够在pH=7.4环境中保持结构稳定,但是在pH=6.5环境中发生裂解,显示出化合物1的pH依赖性骨架稳定性。3氮气吸附-脱附等温曲线结果表明化合物1为可逆的Ⅰ型吸附模式,其饱和吸收量为256 cm3/g,BET比表面积为716 m2/g和Langmui r比表面积892 m2/g,孔的尺寸为6.4 A。化合物1a具有较大的比表面积,为理想的药物负载载体。药物的装载和释放在去溶剂化的1(1a)上进行,结果显示1a可以装载36.4%重量的抗癌药物5-氟尿嘧啶,并以高度控制和渐进的方式在两种不同的pH值磷酸盐缓冲盐水中释放。当PBS溶液pH=7.4时,5-Fu的释放仅在20小时内发生,没有发生“爆释现象”,随着时间增加,并不会导致载体释放出更多的5-Fu。当将PBS溶液的pH值调节至6.5时,与生理pH 7.4相比,5-Fu从1a中释放地更快。同时,可以观察到68%的负载的5-Fu分子在35小时内释放到溶液中。5-Fu负载1a的药物释放曲线表明,与弱碱性条件(模拟血液和正常组织的pH)相比,在模拟的模仿肿瘤细胞微环境条件下,药物释放量增加。4巨正则蒙特卡罗模拟实验结果显示,5-Fu分子更倾向于位于孔道中心,可观察到两个H键相互作用(C-O H距离:2.614A和2.826A)。此外,5-Fu分子中除了 H键存在,开放的Gd(Ⅲ)金属位点和F原子也存在电子相互作用,距离为3.370A。所有这些相互作用都有助于5-Fu与骨架的强结合,从而产生持久的药物释放。5此外,使用MTT法评估1a的生物相容性,结果显示,在这四种不同浓度的1a溶液中,肝癌细胞株BEL-7404和口腔表皮细胞的细胞活力都很高,尽管浓度高达200 μg/mL,两种细胞仍然能保持超过80%的细胞存活率,说明针对正常细胞和肿瘤细胞,化合物1a的毒性较小,表明这种新型的药物载体具有良好的生物相容性。结论:1我们通过[Gd(N03)3](H20)6和H3BCB配体的溶剂热法,成功地设计了一种新型的金属-有机框架Gd(Ⅲ)-MOF(1),研究表明这种新型的药物载体具有较高的热稳定性和pH依赖性骨架稳定性、具有较大的比表面积,为理想的药物负载载体。2新型的金属-有机框架Gd(Ⅲ)-MOF(1)对正常细胞和肿瘤细胞的毒性较小,表明其具有良好的生物相容性。第二部分Gd(Ⅲ)-MOF装载5-FU对人肝癌细胞的体内超声引导下、体外增殖抑制作用的研究目的:对该装载抗癌药物5-Fu的新型的金属-有机框架(5-Fu@1a)进行药效学评价,包括体外细胞实验和超声引导的动物实验。材料与方法:采用四唑盐(MTT)比色法分析5-Fu@1a对人肝癌细胞株BEL-7404是否存在抑制作用。对荷人肝癌BEL-7404裸鼠瘤内注射装载抗癌药物5-Fu的新型的金属-有机框架(5-Fu@1a)与瘤体内注射抗肿瘤药物5-Fu和瘤内注射生理盐水进行比较。本研究采用超声引导瘤内多点注射给药的方法,能够实时观察进针路径及注药情况,使药物准确均匀地分布于整个瘤体,同时超声造影评价5-Fu@1a瘤内注射的实验疗效。结果:1体外抗肿瘤结果发现,20 μg/mL的5-Fu@1a能够杀死约30%的肝癌细胞株BEL-7404,随着时间的增加,更多的癌细胞发生死亡,表明5-Fu从1a中持续释放,通过使用1a作为载体,5-Fu的抗癌效率得到了很大改善。2体外动物实验发现,同等载药剂量的金属-有机框架较后两者能显著抑制肿瘤的生长,5-Fu@1a能够显著抑制肿瘤的生长,抑制肿瘤血管生成。本研究中5-Fu@1a瘤内注射组的动物精神活动状态良好,无萎靡、消瘦,未出现明显的不良反应。模型组肿瘤周边分支血管增强明显,继而肿瘤实质大部快速斑片状强化,并迅速消退;5-Fu组肿瘤实质超声造影增强的范围仅限于肿瘤周边和少许实质斑片样强化;5-Fu@1a组治疗3周后肿瘤周边少许增强,实质大部呈充盈缺损改变,峰值基础强度差(peak-base intensity difference,PBD)显著低于其他两组,超声造影定量分析显示5-Fu@1a能抑制肿瘤血管生成。结论:装载抗癌药物5-Fu的新型的金属-有机框架1a具有有效的抗癌能力,能够显著抑制肿瘤的生长,抑制肿瘤血管生成,有望在肝癌的治疗中得以应用。