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研究背景和目的食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,具有发病率高和死亡率高的特点,危害极大。尽管随着手术、放化疗和其他辅助手段的发展,食管癌的临床治疗取得了明显进步,对延缓肿瘤进展、提高患者生活质量和延长患者生存期有一定效果,但总体上食管癌的远期预后仍很差,5年生存率不足30%。微小RNA(microRNA,miRNA)被证明对肿瘤有重要的调控作用。随着特异性表达的miRNA不断被发现和鉴定,目前已经发现了几十种与人类食管癌有关的miRNA。我们在前期研究中发现miR-4286在食管癌中表达升高,文献报道miR-4286与黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌、前列腺癌等都有关。我们通过软件预测肌醇多聚磷酸-4-磷酸酶 Ⅰ 型(inositol polyphosphate-4-phosphatase type I,INPP4A)为miR-4286的靶基因,但目前尚未见miR-4286、INPP4A参与食管癌的报道。我们拟以miR-4286在食管癌中高表达为切入点,深入探讨miR-4286与食管癌的关系,以及其靶基因INPP4A及JAK2/STAT3信号通路对食管癌生物学行为的影响。第一部分miR-4286及其预测靶基因INPP4A在食管癌组织和细胞株的表达方法:收集75例确诊的食管癌患者癌组织及癌旁正常食管组织,体外培养人食管鳞癌细胞株(TE-1、HCE-4和HCE-7)、人食管腺癌细胞株(SKGT-4和Bic-1)以及正常食管上皮HEEC细胞株,定量PCR或Western blot检测miR-4286、INPP4A在食管癌组织标本和细胞株中的表达水平;分析食管癌中miR-4286和INPP4A表达水平之间的关系。结果1.miR-4286在食管癌组织中表达水平较癌旁正常组织显著升高,是正常食管组织的 3.15 倍(p<0.001);miR-4286 在 TE-1、HCE-4、HCE-7、SKGT-4 和 Bic-1 5种食管癌细胞株中的表达水平分别是正常食管上皮细胞的2.854倍(p<0.01)、2.721 倍(p<0.01)、3.273 倍(p<0.001)、1.915 倍(p<0.05)和 2.421 倍(p<0.01)。2.INPP4A mRNA在食管癌组织表达水平较癌旁正常组织显著降低,是正常食管组织的0.487倍(p<0.01);INPP4AmRNA在食管癌细胞的表达水平均较正常上皮细胞显著降低,在TE-1、HCE-4、HCE-7、SKGT4和Bic-1表达水平分别是正常食管上皮细胞的0.676倍、0.589倍、0.613倍、0.575倍和0.622倍(p均<0.01)。3.INPP4A蛋白在食管癌组织中的表达水平较癌旁正常组织显著降低(p<0.01);INPP4A蛋白在TE-1、HCE-4、HCE-7和SKGT-4 4种食管癌细胞株中的表达水平均较食管正常上皮细胞显著降低(p<0.01)。4.食管癌组织中miR-4286和INPP4A mRNA的表达量呈负相关,|r|=0.675,p<0.001。结论1.miR4286是一个食管癌相关因子,在食管癌组织和细胞株中高表达;2.INPP4A是miR-4286的一个下游预测靶基因,在食管癌组织和细胞株中低表达,与miR-4286水平呈负相关。第二部分 miR-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭的机制方法:1.在食管癌HCE-7细胞株中利用双荧光素酶报告基因检测系统证实miR-4286和INPP4A之间存在相互作用,INPP4A是miR-4286的靶基因;将miR-4286 minic/inhibitor转染食管癌细胞,定量PCR和Western blot检测食管癌细胞中INPP4A、JAK2、STAT3的表达,同时检测与细胞增殖、凋亡、侵袭性相关的细胞因子 BCL-2、BAX、Caspase、E-cadherin、N-cadherin 等的表达;MTT 法检测细胞存活,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。2.将 INPP4A siRNA 单独或联合 miR-4286 inhibitor 转染食管癌细胞,Western blot检测INPP4A、JAK2、STAT3表达水平,MTT法检测细胞存活,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:1.miR-4286和INPP4A基因的3’-UTR野生型重组报告质粒共转染HCE-7细胞后的荧光素酶活性显著降低,说明INPP4A是miR-4286的直接作用靶点。2.miR-4286 mimic 组 INPP4A mRNA 表达是对照组的 0.37 倍(p<0.001);miR-4286 inhibitor组 INPP4A mRNA 表达是对照组的 2.88 倍(p<0.001);mimic NC组和 inhibitor NC 组 INPP4A mRNA与对照组无显著差异(p>0.05)。miR-4286 mimic组INPP4A蛋白表达水平低于对照组(p<0.01),miR-4286 inhibitor组INPP4A蛋白表达水平高于对照组(p<0.01),mimic NC组和inhibitor NC组INPP4A蛋白水平与对照组无显著差异(p>0.05)。3.TE-1、HCE-7和Bic-1 3种食管癌细胞株中miR-4286 mimic组细胞存活率分别为 172.12%、170.53%和 144.38%,均较对照组升高(p<0.05),miR-4286 inhibitor组细胞存活率分别为71.38%、56.28%和72.83%,均较对照组降低(p<0.05);3种细胞株的mimic NC组和inhibitor NC组细胞存活率与对照组均无显著差异(p>0.05),说明miR-4286能促进食管癌细胞增殖。4.TE-1、HCE-7和Bic-1 3种食管癌细胞株中miR-4286 mimic组细胞凋亡率分别为 4.67%、4.67%和 4.13%,均较对照组降低(p<0.01);miR-4286 inhibitor组细胞凋亡率分别为14.22%、13.51%和8.64%,均较对照组升高(p<0.05);3种细胞株中mimic NC组和inhibitor NC组细胞凋亡率与对照组均无显著差异(p>0.05),说明miR-4286能抑制食管癌细胞凋亡。5.TE-1、HCE-7和Bic-1 3种食管癌细胞株中miR-4286 mimic组迁移的细胞数分别为137、168和147,侵袭的细胞数分别为142、184和146,均较对照组显著升高(p<0.05),miR-4286 inhibitor组迁移的细胞数分别为76、75和57,侵袭的细胞数分别为66、44和78,均较对照组显著降低(p<0.05),3种细胞mimic NC组和inhibitor NC组迁移和侵袭的细胞数与对照组均无显著差异(p>0.05),说明miR-4286能增强食管癌细胞迁移和侵袭性。6.miR-4286 mimic 组 BCL-2、N-cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、JAK2、STAT3蛋白表达水平较对照组升高(p<0.05),BAX、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、E-cadherin 表达较对照组降低(p<0.05);miR-4286 inhibitor组 BCL-2、N-cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、JAK2、STAT3 表达较对照组降低(p<0.05),BAX、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、E-cadherin 表达较对照组升高(p<0.05)。mimic NC组和inhibitor NC组中以上蛋白表达水平与对照组均无显著差异(p>0.05)。7.si-INPP4A组细胞INPP4A mRNA和蛋白水平均较对照组显著降低(p<0.01),si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组 INPP4A mRNA 和蛋白水平均较 si-INPP4A 组显著升高(p<0.01),si-NC组INPP4A mRNA和蛋白水平与对照组无显著差异(p>0.05),si-INPP4A+miR-4286 NC组INPP4A mRNA和蛋白水平与si-INPP4A组无显著差异(p>0.05)。8.si-INPP4A组细胞存活率为170.34%,显著高于对照组(p<0.01),si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组细胞存活率为 102.05%,显著低于 si-INPP4A 组(p<0.01),si-NC组细胞存活率与对照组无显著差异(p>0.05),si-INPP4A+miR-4286 NC组细胞存活率与si-INPP4A组无显著差异(p>0.05)。9.si-INPP4A组细胞总凋亡率为2.66%,显著低于对照组(p<0.01),si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组细胞凋亡率为 7.78%,显著高于 si-INPP4A 组(p<0.01),si-NC组细胞凋亡率与对照组无显著差异(p>0.05),si-INPP4A+miR-4286 NC组细胞存活率与si-INPP4A组无显著差异(p>0.05)。10.si-INPP4A组细胞相对迁移数和侵袭数分别为147.26%和158.72%,显著高于对照组(p<0.01),si-INPP4A+miR-4286 inhibitor组细胞相对迁移数和侵袭数分别为89.77%和89.89%,显著低于si-INPP4A组(p<0.01),si-NC组细胞相对迁移数和侵袭数与对照组无显著差异(p>0.05),si-INPP4A+miR-4286NC组细胞相对迁移数和侵袭数与si-INPP4A组无显著差异(p>0.05)。11.si-INPP4A组细胞JAK2、STAT3蛋白水平显著高于对照组(p<0.01),si-INPP4A+miR-4286 inhibitor 组细胞 JAK2、STAT3 蛋白表达低于 si-INPP4A 组(p<0.05);si-NC组JAK2、STAT3蛋白水平与对照组无显著差异(p>0.05),si-INPP4A+miR-4286 NC 组 JAK2、STAT3 蛋白水平与 si-INPP4A 组无显著差异(p>0.05)。结论:1.miR-4286高表达能促进食管癌细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强细胞的迁移和侵袭性,并活化JAK2/STAT3信号通路;miR-4286低表达能抑制食管癌细胞增殖、促进细胞凋亡、削弱细胞的迁移和侵袭性,抑制JAK2/STAT3信号通路,说明miR-4286能调控食管癌的恶性表现;2.miR-4286 inhibitor能逆转si-INPP4A所引起的食管癌细胞增殖促进、凋亡抑制和迁移和侵袭性增强的效应,miR-4286对食管癌恶性表型的调控是通过INPP4A实现的。miR-4286靶向INPP4A激活JAK2/STAT3信号通路调控食管癌生长、迁移和侵袭。