目的:研究旨在探究NCSTN基因与反常性痤疮疾病之间的关系,探索NCSTN基因缺陷后导致角质形成细胞增殖、分化及炎症的具体机制。方法:研究利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建NCSTN基因稳定干扰的人永生化角质细胞HaCaT细胞模型,利用RNA测序方法和TMT蛋白标记方法分别检测NCSTN基因稳定干扰的HaCaT细胞模型中的差异基因的mRNA水平和蛋白表达情况,并进行联合分析与验证,通过生物信息学分析结合临床数据,筛选维甲酸信号通路、NF-κB信号通路等相关分子进行验证研究。1.利用课题组已构建好的慢病毒载体介导的靶向NCSTN基因特异性的短发夹RNA表达质粒感染人永生化角质细胞HaCaT细胞,将细胞分为空白组、阴性对照组和干扰组,并分别用Real-Time PCR和Western blot检测其干扰效率。联合采用TMT标记定量蛋白质组学技术对NCSTN基因稳定干扰的HaCaT细胞中的蛋白质表达情况进行分析。2.联合TMT标记蛋白组学和RNA测序技术对NCSTN基因稳定敲降的HaCaT细胞进行分析,并对呈共同表达趋势的top10差异表达基因的mRNA水平进行验证分析。3.通过生物信息学分析并结合临床数据,筛选并检测维甲酸信号通路相关受体分子(RAR α、RAR β、RAR γ、RXR α、RXR β、RXR γ、PPAR γ、RARRES1、RARRES2),以及 NF-κB 信号通路(NFKB1、NFKB2、REL、NFKBIA)的 mRNA 表达情况。结果:1.慢病毒感染HaCaT细胞后,与空白组及阴性对照组相比,Real-Time PCR结果显示,干扰组NCSTN基因mRNA水平显著降低(P<0.001),其干扰效率达到了75.0%;Western blot结果显示,其干扰效率达到了 71.7%。运用TMT标记定量蛋白质组学技术分析NCSTN基因稳定干扰的人永生化角质细胞HaCaT后,我们发现差异表达蛋白数为23个,这些差异表达蛋白中由12个蛋白下调,11个蛋白上调。GO富集分析显示,基因属性中聚类最多的功能分别为:黑素小体、色素颗粒、薄膜筏、薄膜区等等。2.运用RNA测序技术和TMT标记定量蛋白质组学技术联合分析后,我们发现多种基因差异表达、多条信号通路发生改变。两种检测技术中共同上调的前9个基因和共同下调的前10个基因的Real-Time PCR结果显示,基因LRBA、DSG3、SNX2、OAS3、ATP2B1、LZIC、VSNL1、UQCRFS1的mRNA表达水平上调,与测序结果一致;基因 KIAA0020、C15orf52、NCSTN、PSEN2、LACTB、DNTTIP2、CDH2、CDH4、SCAF1、IDH1的mRNA表达水平上调,与测序结果一致。3.NCSTN基因稳定干扰后,维甲酸信号通路相关受体分子RAR α、RARβ、RXRα、RARRES1的表达较对照组表达均显著下降(P<0.001),PPARγ明显下降(P<0.01),RARγ、RXRβ、RXRγ、RARRES2的差异不显著,无统计学意义。NF-κB信号通路相关细胞因子NF-κB1、NF-κB2、REL表达均显著降低(P<0.001),NFKBIA的差异不显著,无统计学意义。结论:本研究探讨了NCSTN基因功能缺陷对HaCaT细胞的影响,利用TMT蛋白质组学技术和RNA高通量测序技术联合分析与验证,初步证实了NCSTN基因功能缺陷会导致角质形成细胞中维甲酸信号通路和NF-κB信号通路的受损,结合AI患者中用维A酸类药物进行临床治疗是有效的,进一步佐证了维甲酸信号通路参与了 AI的发生发展。