【摘 要】
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体外受精、体细胞核移植、转基因等技术是大动物繁殖生物技术的重要内容,这些技术需要用到卵母细胞,因此卵母细胞成熟调控对于大动物繁殖生物技术来说很重要,但是由于大动物的饲养和实验成本较高,而小鼠繁殖周期短,饲养管理和实验成本较少,且可控制生长和实验条件,可以作为研究大动物卵母细胞成熟机制的模型。高孕激素环境下超促排卵（progestin primed ovarian stimulation（PPOS）
【基金项目】
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上海自然科学基金15ZR1424900；
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体外受精、体细胞核移植、转基因等技术是大动物繁殖生物技术的重要内容,这些技术需要用到卵母细胞,因此卵母细胞成熟调控对于大动物繁殖生物技术来说很重要,但是由于大动物的饲养和实验成本较高,而小鼠繁殖周期短,饲养管理和实验成本较少,且可控制生长和实验条件,可以作为研究大动物卵母细胞成熟机制的模型。高孕激素环境下超促排卵（progestin primed ovarian stimulation（PPOS））方案作为上海交通大学医学院附属第九人民医院独创性的方案,使用人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin,h MG）及口服孕激素-安宫黄体酮（Medroxyprogesterone 17-acetate,MPA）进行人超促排卵。PPOS促排卵方案相比于其他方案更高效、更安全、更灵活,人临床取卵经验表明PPOS方案与其他方案相比可以获得较灵活的取卵时间窗。因此本研究旨在探究PPOS方案对小鼠卵母细胞成熟和排卵的影响,由于小鼠和人都是哺乳动物,并且其卵母细胞和早期胚胎与人的相似（均透明）,是用于临床胚胎实验操作的动物模型。本研究可以为非人灵长类和大动物高孕激素环境下卵母细胞成熟机制的研究提供借鉴和参考。我们回顾性研究了上海九院2013年1月至2018年7月进行的12189例PPOS方案患者和3384例微刺激患者。结果发现微刺激方案中有96.45%患者的取卵时间集中在33-36小时,而PPOS方案中有95.42%患者的取卵时间偏后,集中在35-39小时。由此相比于微刺激方案,PPOS方案的取卵时间虽偏后,但其整个取卵时间窗内（33-39小时）均可取到成熟率达80%的卵母细胞。这与临床观察到的PPOS方案具有非常灵活的取卵时间现象一致。我们在小鼠上建立PPOS及其对照促排卵方案,观察PPOS方案对小鼠排卵和成熟进程的影响,对收集到的卵母细胞进行核DNA的荧光染色,根据核形态区分卵母细胞的不同发育时期,同时眼球采血收集小鼠血清进行激素测定。结果显示在小鼠注射HCG后的12、12.5、13小时PPOS方案组输卵管收集到的卵母细胞数量显著少于对照组（P＜0.05）,卵巢剩余未排的卵母细胞数量显著多于对照组（P＜0.05）。且两组卵巢和输卵管内卵母细胞的成熟率无显著差异。给予HCG后0、7、8、10、11小时,观察PPOS方案对小鼠卵子成熟进程的影响。发现HCG后第7小时PPOS组MⅠ和MⅡ期卵母细胞数量极显著多于对照组（P＜0.01）,HCG后第11小时MⅡ期卵母细胞比例极显著高于对照组（P＜0.001）,从激素水平探究其机制,发现在小鼠卵子成熟进程中（给予HCG后0-11 h）,PPOS组HCG后8小时P4水平极显著高于对照组,HCG后10小时P4下降并显著低于对照组。在排卵进程,HCG后12小时,PPOS方案组P4水平低于对照组（无统计学意义）,但之后PPOS组P4水平开始上升在12.5小时显著高于对照组,第13小时达到较高的水平,并极显著高于对照组,之后开始下降,在第15小时显著低于对照组,并最终在第16小时与对照组水平相等。上述实验表明,小鼠PPOS方案组卵母细胞从卵巢排到输卵管的时间有延后的趋势。相比于对照方案,PPOS方案恢复第一次减数分裂以后的成熟进程加快,并提前成熟。血清孕激素在成熟和排卵的关键时间点与对照相比存在显著差异的水平。因此我们推测卵母细胞成熟进程的加快可能是由于某些未知的信号通路激活了促进卵母细胞成熟的相关因子。排卵前,由于大量给予了外源性高浓度的P4,可能导致内源性受体脱敏,从而影响了卵泡壁破裂相关蛋白的表达,延迟了排卵进程。小鼠的研究验证了临床上PPOS方案取卵时间虽延后,但在其整个较长的取卵时间窗,都能取到成熟率＞80%的卵母细胞。我们的研究将为畜牧生产中,高剂量孕激素预处理进行超促排卵提高卵母细胞成熟率的可行性提供理论依据。为非人灵长类和其他哺乳动物高孕激素水平下探究卵母细胞体内成熟的机制,以及不孕濒危灭绝物种后代的保留及生产提供科学依据。
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